这项研究针对大黄鱼肌母细胞体外扩增中的血清依赖问题，开发了一种成分简单、成本低廉的无血清培养基。研究团队首先通过Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计对11种潜在生长因子进行系统筛选，包括L-肉碱、亚油酸、胆固醇、维生素E、叶酸、氢化可的松、孕酮、硫辛酸、乙醇胺、TGF-β1和肌醇。实验结果显示，乙醇胺、孕酮、L-肉碱和维生素E对细胞增殖影响最为显著，但仅这四种因子组合的效果远不及11种因子联合使用。

在确定最佳因子组合后，研究者进一步考察了牛血清白蛋白浓度对细胞活力的影响，发现5 mg/mL BSA效果最佳。随后通过逐一排除法简化培养基配方，最终确定氢化可的松是唯一必需的外源添加因子。由此获得的无血清培养基配方为DMEM/F12基础培养基、5 mg/mL BSA、20 mmol HEPES、1%青霉素/链霉素和2 ng/mL氢化可的松。

细胞培养实验表明，该无血清培养基能有效支持大黄鱼肌母细胞的贴壁、扩增和分化。培养3天后，活细胞数量达到血清培养基的65%，群体倍增时间和扩增倍数与血清培养基无显著差异。细胞表征分析显示，无血清培养条件下肌母细胞的标志基因MyoD1、Pax3和Pax7表达正常，Pax7和MyoD1蛋白阳性率接近100%，表明细胞特性未发生改变。

值得注意的是，无血清培养基中的肌母细胞表现出独特的增殖动力学。EdU掺入实验和细胞周期分析显示，细胞在培养初期增殖较慢，随后逐渐适应无血清环境并进入快速增殖期，而血清培养基中的细胞增殖则随培养时间延长逐渐下降。这种适应性增殖模式提示肌母细胞能够逐步激活内源性增殖程序。

图1 图1. 肌母细胞体外扩增的生长因子组合筛选

分化能力评估显示，无血清培养的肌母细胞分化后形成更多肌管，融合指数显著高于血清培养组，表明该培养基不仅维持而且可能促进了细胞的分化潜能。

转录组测序揭示了氢化可的松的作用机制。差异表达基因分析显示，无血清培养条件下1621个基因显著上调、1905个基因显著下调。信号通路分析表明，氢化可的松可能作为配体与G蛋白偶联受体结合，激活G蛋白βγ亚基，进而触发下游PI3K/AKT信号通路，促进细胞存活和增殖。同时，研究还发现无血清培养基缺乏激活TGF-β信号通路和黏着斑信号通路的因子，导致微管蛋白α和肌动蛋白相关基因表达上调，这可能解释了无血清培养条件下细胞形态较为松散的现象。

该研究成功开发了一种仅含单一生长因子的无血清培养基，为鱼类细胞培养肉的规模化生产提供了经济可行的技术方案，并通过多组学分析揭示了糖皮质激素调控鱼类肌母细胞增殖的分子机制。

国内生物科技企业广东环凯生物科技有限公司也已开发出适用于兽用疫苗生产的无血清培养基系列产品，为兽用生物制品的无血清工艺国产化提供了重要支撑。

来源：10.1016/j.foodres.2024.115073