研究背景

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度接触性、出血性传染病，致死率接近100%，被世界动物卫生组织（WOAH）列为法定报告动物疫病。自1921年在肯尼亚首次报道以来，ASF已在全球范围内造成毁灭性影响。根据WOAH 2026年2月发布的最新报告，自2022年1月以来，全球已有72个国家和地区报告ASF存在，累计报告家猪病例1184575例，野猪病例47510例，家猪损失高达2490557头。目前，全球ASF疫苗研发呈现多技术路线并进格局，但进展不一，亚单位疫苗作为最安全的疫苗类型之一，亚单位疫苗不含活病毒，彻底杜绝毒力返强风险。然而，传统亚单位疫苗因ASFV基因组庞大（编码150余种蛋白）、结构复杂，单独使用时免疫原性较弱，难以诱导完全保护。而mRNA疫苗目前仍处于早期研究阶段。在此背景下，开发既能保证安全性、又能诱导 robust 免疫保护的新型疫苗平台成为全球ASF防控的迫切需求。

研究方法

多表位蛋白的理性设计与合成：首先先进行文献检索与蛋白筛选，通过检索PubMed数据库，筛选出p54、p30、p72、p22、CD2v、p12、p15、p35和EP153R等9个具有部分保护效果的ASFV蛋白，最终确定6个序列保守性最高的蛋白（CD2v、j18L、p72、pp62/p15、C-type lectin、p10）作为表位来源。再使用Pickpocket 1.1服务器预测8-11mer肽段与猪白细胞抗原（SLA-10401和SLA-21002）的结合亲和力，进行表位预测，选择高亲和力表位。然后将选定的10个表位（9-15个氨基酸）通过GPGPGP柔性连接肽和AAY蛋白酶体切割位点连接，构建约24 kDa的合成多表位蛋白。最后进行表达纯化：将基因片段克隆至pRSET A质粒，转化BL21(DE3)大肠杆菌进行自诱导表达，通过镍亲和层析纯化获得目的蛋白。  

纳米颗粒疫苗制备与表征：采用离子凝胶法对M-CS纳米颗粒进行制备，将1.0%低分子量壳聚糖溶液与ASF蛋白或ADU-S100佐剂混合，以三聚磷酸钠（TPP）为交联剂制备纳米颗粒。使用Zetasizer Nano ZS90测定粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位进行理化性质检测，从而评估纳米颗粒的载药效率。（ASF蛋白载药效率70.2%，ADU-S100载药效率79.75%）   动物实验设计：选用18头4-6周龄大白×杜洛克杂交仔猪作为实验动物，随机分为3组（每组6头），其中第1组：Mock对照组（2 mL PBS）、第2组：M-CS ASF蛋白 + M-CS ADU S100（1.5 mg ASF蛋白 + 50μg佐剂）、第3组：ASF蛋白 + M-CS ADU S100（1.5 mg游离ASF蛋白 + 50μg佐剂）。免疫程序设置为：DPV 0天首免（颈部右侧肌肉注射），DPV 22天采血并加强免疫（颈部左侧肌肉注射），DPV 42天安乐死并采集组织。最后进行安全性评价，采用DPV 42天通过胸围法估算体重，评估疫苗全身不良反应。 

免疫学检测方法：采用T细胞增殖试验：分离PBMC，以10μg/mL多表位蛋白刺激48小时，MTS/PMS法检测增殖指数；ELISA检测抗体滴度：以20μg/mL多表位蛋白包被96孔板，HRP标记山羊抗猪IgG检测特异性抗体；抗体亲和力ELISA：采用硫氰酸铵（NH4SCN）洗脱法，检测抗体-抗原结合稳定性；流式细胞术：分析CD3+CD4+CD8α+辅助性T细胞和CD3+CD4-CD8α+CD8β+细胞毒性T细胞比例；qPCR检测细胞因子基因表达：提取脾脏和浅表颈淋巴结RNA，检测IL-6和IL-10的mRNA表达水平。

研究结论

多表位蛋白的设计与表达验证：研究团队成功构建了包含10个保守表位的多表位蛋白，涵盖ASFV的6个关键免疫蛋白（图1A-B）。SDS-PAGE和Western blot验证显示，蛋白表达量高，分子量约24 kDa，与预期一致（图1C）。

纳米颗粒疫苗的安全性与理化特性：疫苗安全性评价显示，M-CS ASF蛋白疫苗未引起猪只体重下降或注射部位局部病变，与Mock组相比无统计学差异，证明该纳米颗粒制剂具有良好的生物相容性（图2）。

M-CS纳米颗粒增强体液免疫应答：ELISA结果显示，M-CS ASF蛋白疫苗组在DPV 22天即可检测到特异性IgG抗体，而游离ASF蛋白组此时未出现明显抗体应答。DPV 42天，两组疫苗免疫组的抗体滴度均显著高于Mock组（p < 0.01），且M-CS纳米颗粒组的抗体应答更为 robust（图3）。

M-CS纳米颗粒诱导更高亲和力抗体： 抗体亲和力ELISA采用硫氰酸铵洗脱法评价抗体结合强度。结果显示，M-CS ASF蛋白疫苗在DPV 22天即可诱导高亲和力抗体，在5M NH4SCN浓度下仍有约20%抗体保持结合；而游离蛋白组抗体亲和力较低。DPV 42天，M-CS组的抗体亲和力在各浓度硫氰酸铵处理下均优于游离蛋白组（图4）。

细胞免疫应答的诱导：PBMC刺激试验显示，疫苗组T细胞在抗原再刺激后呈现增殖趋势，DPV 42天M-CS ASF蛋白组的刺激指数高于Mock组（图5），提示疫苗诱导了抗原特异性T细胞记忆。

T细胞亚群分析：流式细胞术检测显示，M-CS ASF蛋白疫苗组DPV 42天的CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞比例均高于Mock组（图6），虽然统计学差异未达显著水平（p > 0.05），但呈现明确的免疫激活趋势。  

免疫基因表达特征：qPCR分析显示，与游离ASF蛋白组相比，M-CS ASF蛋白疫苗组的脾脏和淋巴结中IL-10（抗炎因子）和IL-6（促炎因子）表达均下调（图7），其中脾脏IL-10表达显著降低（p < 0.0001）。这一“低炎症”免疫特征提示纳米颗粒疫苗能够在诱导适应性免疫的同时，避免过度的系统性炎症反应，具有更优的安全性 profile。  

结论与展望

本研究的核心价值在于验证了M-CS纳米颗粒递送系统对ASF亚单位疫苗免疫原性的显著增强作用。壳聚糖纳米颗粒作为疫苗载体具有多重优势：生物相容性好、可保护抗原免受降解、实现抗原的缓释和靶向递送（通过甘露糖受体介导的抗原提呈细胞摄取），并能增强抗原交叉提呈，从而同时激活体液免疫和细胞免疫。然而，ASFV的复杂性和变异性决定了疫苗研发仍面临诸多挑战。未来，需要国际社会的协同努力，建立标准化的疫苗评价体系，推进DIVA（区分感染与免疫动物）策略，并加强疫情监测和生物安全体系建设。只有将科技创新与综合防控相结合，才能真正实现对这一百年猪疫的有效控制，保障全球猪肉产业的可持续发展和粮食安全。

参考文献链接：https://doi.org/10.3390/vaccines14020187