研究背景

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种α冠状病毒，自2010年高致病性变异株出现以来，已造成全球养猪业数十亿美元经济损失。该病毒主要攻击小肠上皮细胞，引起仔猪水样腹泻、呕吐和脱水，10日龄内仔猪感染致死率可达80%-100%。当前商用疫苗（主要为灭活苗和弱毒苗）存在免疫原性不足、潜在毒力返强风险、交叉保护效果差等局限，难以应对不断变异的流行毒株。而亚单位疫苗的技术瓶颈是构象决定免疫成败，其中PEDV的S蛋白（刺突蛋白）是诱导中和抗体的关键抗原，天然状态下以同源三聚体形式存在。S1亚单位包含受体结合域（RBD）和绝大多数中和表位，是疫苗设计的理想靶标。然而，传统S1单体或二聚体形式的重组疫苗往往因无法维持天然三聚体构象，导致关键的中和表位暴露不足，免疫效果大打折扣。如何“锁定”S蛋白的预融合三聚体状态，成为亚单位疫苗研发的核心挑战。  Trimer-Tag技术通过人工设计的三聚化基序（如T4纤维蛋白）与靶抗原融合表达，利用二硫键稳定同源三聚体结构，可在真核表达系统中高效制备“天然样”构象的抗原。该技术已在人类RSV疫苗（三叶草生物SCB-1019）中完成临床验证，拥有超过40000剂的安全数据库，其平台价值正快速向动物疫苗领域延伸。

研究方法

抗原设计与构建：首先选取PEDV S1亚基（19-734 aa），在N端引入信号肽，C端通过柔性Linker（GGGGS）融合Trimer-Tag（T4 fibritin）和6×His标签。其次构建对照组：全长S蛋白（21-1329 aa）表达质粒（PKS001-S），同样携带His标签和Flag标签。最后采用人胚肾细胞（HEK293）真核表达系统，通过瞬时转染实现蛋白分泌表达。

蛋白表达与纯化：转染后培养上清经高速离心澄清，然后采用Ni亲和层析纯化目标蛋白G25葡聚糖凝胶过滤脱盐，缓冲液置换为1×PBS（pH 7.4）。

三聚体构象验证：采用SEC-HPLC-MALS（体积排阻高效液相色谱-多角度激光光散射）联用技术，以牛血清白蛋白（BSA，理论66 kD，实测64 kD）和IL-6R（理论150 kD，实测144.5 kD）作为标准品验证仪器准确性，测定S1-Trimer绝对分子量，确认其以三聚体形式存在。

动物免疫实验：①小鼠模型：小选用30只6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为PBS对照组、S1-Trimer组（25μg）、全长S蛋白组（25μg），于第0、2周肌肉注射免疫，第6周处死取材。

②母猪模型：9头妊娠母猪（产前35天），分三组免疫（100μg/头），于产前35天和14天各免疫一次，收集血清、初乳和常乳。

③仔猪攻毒保护：从免疫母猪所产仔猪中各选5头5日龄仔猪，口服攻毒PEDV JS/SJ-2022强毒株（106 TCID50/mL），观察9天。

免疫学检测：用ELISA检测血清、肠组织、初乳中的PEDV特异性IgG和IgA；然后再进行病毒中和试验（VNT）：56℃灭活30分钟后，与200 TCID50病毒37℃作用1小时，接种Vero-CCL81细胞观察CPE；最后通过RT-qPCR检测肛拭子病毒载量（PEDV-N基因引物）。

病理学评价：仔猪空肠组织4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，3μm切片，HE染色，光学显微镜观察绒毛结构、黏膜上皮完整性及固有层病变。

统计分析：使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，GraphPad Prism 8.0作图（P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异）。

研究结论

S1-Trimer成功表达并形成稳定三聚体结构：SDS-PAGE证实S1-Trimer和全长S蛋白均高效表达（图1A-C）。SEC-HPLC-MALS分析显示，S1-Trimer主峰分子量为372 kD，与理论三聚体分子量高度吻合，证实其以稳定的三聚体形式存在于溶液中（图1E）。结构模拟图显示，S1-Trimer呈现出与天然S蛋白相似的球状三聚体构象（图1D）。

小鼠模型：S1-Trimer诱导的抗体应答与全长S蛋白相当。免疫后第2周（首免后），S1-Trimer和S-FL组均检测到PEDV特异性IgG、IgA和中和抗体；第4周（二免后）抗体水平显著升高。S1-Trimer组与S-FL组的血清IgG（图2B）、IgA（图2C）、中和抗体滴度（图2D）及肠组织IgG/IgA（图2E-F）均无显著差异，但均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。

母猪模型：高效诱导系统性及黏膜免疫应答（图3A）。免疫期间母猪无临床症状，无流产或死亡。二免后，S1-Trimer和S-FL组母猪血清中IgG、IgA（图3B-C）及中和抗体（图3D）水平均显著升高，且两组间无显著差异。更重要的是，初乳中同样检测到高滴度IgG（图3E）、IgA（图3F）和中和抗体（图3G），为仔猪被动免疫保护奠定基础。  

仔猪保护效力：显著降低病毒载量与病理损伤。攻毒前，免疫组仔猪血清中已存在高滴度IgG、IgA和中和抗体（图4A-C），肠组织中也检测到显著抗体水平（图4D-E）。攻毒后，S1-Trimer和S-FL组仔猪粪便病毒载量（图4F）在感染后4天（DPI 4）达到峰值，但显著低于PBS对照组（P<0.01），且两组间保护效果相当。 

临床症状与病理学：完全保护肠道结构完整性。PBS对照组仔猪在攻毒后第2天出现严重水样腹泻，小肠水肿、肠壁变薄、透亮（图5A，绿色箭头）；而S1-Trimer和S-FL组仅第4天出现轻度腹泻，2天内迅速恢复，精神状态与粪便形态正常。HE染色显示：空白对照组和疫苗组仔猪空肠黏膜结构完整，绒毛排列整齐，上皮细胞连续（图5B）；PBS对照组则出现绒毛顶端上皮细胞脱落、固有层坏死伴嗜酸性均质染色等典型PEDV病变。  

结论与展望

Trimer-Tag技术在本研究中展现出的“以S1替S全长、以三聚体替单体”的策略，本质上是对疫苗抗原进行了分子瘦身与构象锁定的双重优化。这一思路与mRNA疫苗的“序列精准设计”异曲同工，代表了动物疫苗研发的未来方向。本研究将这一平台首次系统应用于PEDV疫苗，证实了其跨物种、跨病原的平台化扩展能力。相比传统疫苗，S1-Trimer作为分泌型蛋白，分子结构相对简单，易于在昆虫细胞-杆状病毒系统或CHO细胞平台实现规模化生产，具备快速响应新变异株的模块化设计优势。PEDV疫苗正处于从“传统灭活/弱毒苗”向“精准设计疫苗”转型的关键窗口期。然而，技术先进不等于市场成功——谁能率先解决多价广谱保护、低成本规模化生产、与现有免疫程序的兼容性这三大痛点，谁就能在PEDV疫苗的下一轮竞争中占据制高点！

参考文献链接：https://doi.org/10.1016/j.virol.2026.110823