大豆蛋白“借壳”胎牛血清：一种完全无动物成分培养基的跨细胞系验证

这项研究成功开发了一种完全无动物成分（ACF）的细胞培养基，并系统评估了其对四种常用贴壁细胞系的长期培养效果。研究团队通过多步骤优化方法，从文献综述中确定了基础培养基（DMEM/F-12）和关键添加剂组合，包括重组人白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、乙醇胺以及生长因子（EGF、FGF2）。通过矩阵筛选法调整TGFβ、FGF2、EGF和PGE2的浓度，最终确定以最低有效浓度维持细胞活力和形态学特征的配方。针对NIH 3T3成纤维细胞的初始优化显示，虽然无涂层ACF培养基能维持高存活率，但细胞呈现细长纺锤形态且贴壁不良，提示需要基质涂层辅助。

为解决贴壁问题，研究比较了明胶涂层和新型大豆蛋白水解物涂层的效果。短期培养（7天）结果表明，添加明胶或大豆涂层后，ACF组的细胞浓度与FBS对照组无显著差异，且存活率均高于94%。长期培养（90天）进一步验证了大豆涂层的优越性：ACF+大豆组在第90天的细胞浓度显著高于FBS组，而ACF+明胶组和无涂层组与对照无显著差异。所有ACF组在长期培养中均保持高存活率（>95%），其中ACF+明胶组的活细胞比例甚至显著高于FBS组。

形态学定量分析通过共聚焦显微镜测量核面积、细胞体面积及核质比（N:C）。结果显示，FBS组与ACF+大豆组的核面积（118.4±1.3 μm² vs 114.5±1.1 μm²）和细胞体面积（876.7±15.6 μm² vs 854.1±17.5 μm²）高度相似，而ACF+明胶组的细胞显著增大（核面积152.7±1.6 μm²，细胞体面积1129.7±20.4 μm²），无涂层组则明显缩小。仅无涂层组的N:C比与FBS组存在显著差异，两种涂层均能恢复正常的核质比例，证明大豆涂层可有效替代明胶维持细胞形态。

图1 无血清培养基开发的模块化方法示意图

转录组学分析检测了84个与细胞周期、凋亡和细胞外基质（ECM）相关的基因。火山图和聚类分析显示，无涂层ACF组有54个基因、ACF+明胶组40个基因、ACF+大豆组39个基因与FBS组无显著差异。差异表达基因主要集中在细胞周期调控和ECM黏附功能。所有ACF组均下调了CDC7、CDKN3、CHEK1、WEE1等细胞周期基因（2-5倍），以及ITGA5、CCN2、FN1等ECM基因（2-14倍），同时上调了LAMA2（2-14倍）和DAPK1（5-6倍）。ACF+明胶和ACF+大豆组特异性上调了抗炎因子IL10（12-28倍）和促炎因子PYCARD，提示涂层可能调节炎症信号通路。这些分子变化反映了细胞对无血清环境的适应性调整，但未影响整体活力和形态稳定性。

该ACF培养基在多种细胞系中展现了广泛的适用性。针对C2C12小鼠成肌细胞、MC3T3小鼠前成骨细胞和人包皮成纤维细胞（HFF）的测试表明，通过调整基础培养基（DMEM用于C2C12，αMEM用于MC3T3）和FGF2浓度（从1 ng/mL提高至30 ng/mL），并保留TGFβ（5 ng/mL），ACF+大豆培养基在30天培养后使所有三种细胞系的细胞浓度显著高于FBS对照组，存活率均保持在86%以上，且形态学特征（如C2C12的融合排列、MC3T3的结节形成）与FBS组一致。

配方优化过程中，研究排除了PGE2并发现TGFβ对成纤维细胞非必需但对成肌细胞和前成骨细胞有益，体现了不同细胞类型对生长因子的特异性需求。大豆蛋白水解物涂层的作用机制可能涉及其中的 lunasin 蛋白提供RGD黏附序列，或通过改变表面电荷促进蛋白吸附和整合素结合。该研究为无血清培养基开发提供了可复制的模块化框架，证明植物源性成分可完全替代动物源性涂层，在维持细胞增殖、形态和基因表达稳定性的同时，解决了FBS的批次差异、伦理争议和成本波动问题。

来源：Nicolette B. Mogilever, Marie-Hélène Godin Pagé, Anjolaoluwatikiitan Solola, Andrew E. Pelling. bioRxiv 2025.02.05.636679; doi: https://doi.org/10.1101/2025.02.05.636679