研究背景

目前全球禽业集约化程度持续提升，免疫抑制性疫病混合感染已成为行业核心痛点。鸡传染性贫血（CIA）作为典型代表，由CIAV感染引发，主要侵害幼鸡造血与免疫器官，导致贫血、免疫抑制，大幅降低禽流感、新城疫等常规疫苗效力，引发继发感染与大规模死亡，每年造成巨额经济损失。现有CIA防控疫苗存在致命缺陷：弱毒疫苗存在毒力返强风险，生产依赖鸡胚/活禽，成本高、扩产难；灭活疫苗免疫原性不足，需多次接种；亚单位/ DNA疫苗递送效率低、免疫效果差，且均无法实现幼鸡安全早期免疫。同时，黏膜疫苗成为兽用疫苗研发热点，其可诱导全身+局部免疫、给药便捷、动物应激小，但抗原递送系统瓶颈制约研发推进。柔嫩艾美耳球虫天然嗜肠道黏膜、安全性高、可激发强效免疫，是理想的活疫苗载体，为CIA新型疫苗研发提供全新路径。

研究方法

载体与抗原元件设计：构建四质粒共转系统，整合CIAV多拷贝VP1/VP2抗原、分子佐剂C3d三聚体，搭配EYFP、mCherry、DHFR-TSm2m3、PRS四种筛选标记，采用高活性启动子驱动表达。

转基因球虫转染：通过限制性内切酶介导整合（REMI）技术，将线性化质粒电转柔嫩艾美耳球虫子孢子，经泄殖腔途径接种7日龄雏鸡。

重组株筛选与纯化：用乙胺嘧啶+卤夫酮双药压力筛选，结合荧光激活细胞分选（FACS）富集双荧光阳性卵囊，连续传代2代，使重组株阳性率稳定超90%，获得Et-TetVP1VP2。

生物学特性鉴定：检测子孢子、裂殖子、卵囊阶段荧光表达；测定卵囊排出量、盲肠病变评分、体重增益，评估繁殖力与致病性。

免疫程序与效果检测：采用初免-加强策略：初免1×10³卵囊/只，14天后加强免疫1×10⁴卵囊/只；ELISA检测VP1/VP2特异性抗体，ELISpot 检测 IFN-γ分泌细胞，评估体液与细胞免疫。

攻毒保护试验：CIAV肌肉注射攻毒，剖检骨髓、胸腺、脾、肝病理损伤；qPCR定量血液病毒载量，组织PCR检测病毒分布。

统计分析：用GraphPad Prism 10.0进行Mann-Whitney U检验与Dunnett多重比较，p<0.05为差异显著。

研究结论

重组株Et-TetVP1VP2构建与验证：PCR与Western blot证实VP1/VP2融合蛋白稳定表达；FACS分选后双荧光阳性率> 90%，遗传性状稳定（图1）。

重组株生物学特性分析：重组株全生活周期稳定表达荧光报告基因；卵囊排出量低于野生型，繁殖力适度降低；盲肠病变与野生型无显著差异，低剂量组体重增益更优，致病性减弱（图2）。

特异性免疫应答检测：初免后抗体无显著升高，加强免疫后VP1/VP2抗体水平显著上升；IFN-γ分泌细胞数显著高于野生型，激活T细胞免疫与记忆应答（图3）。

攻毒后病理损伤评估：野生型免疫组出现骨髓发育不良、胸腺萎缩、脾肝坏死等典型CIA病变；Et-TetVP1VP2免疫组器官结构接近PBS对照组，无明显损伤（图4）。

血液病毒载量定量：攻毒7天、14天，免疫组血液病毒载量分别为8.13×10³、1.05×10⁴拷贝/μL，显著低于野生型组的 1.07×10⁴、1.74×10⁴拷贝/μL；组织病毒扩增信号更弱（图5）。

结论与展望

该研究首次实现柔嫩艾美耳球虫口服载体共表达CIAV双抗原，验证活载体黏膜疫苗防控禽免疫抑制病的可行性，为多病原疫苗开发提供通用平台。且口服给药无应激、适配规模化养殖，破解了幼鸡早期免疫空白，降低了混合感染风险，契合减抗、绿色养殖政策导向。该项研究成果完善了家禽黏膜疫苗技术体系，提升我国兽用疫苗自主研发能力，打破国外高端疫苗技术壁垒。未来随着技术迭代，这类新型疫苗将成为禽病防控的核心工具，推动我国从“养殖大国”向“养殖强国”升级。

参考文献链接：https://doi.org/10.1038/s41541-026-01416-w