"关门开窗"现象揭示噬菌体鸡尾酒新策略！

铜绿假单胞菌感染威胁严峻，快速检测需求迫切催生噬菌体蛋白识别元件新策略

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种重要的革兰氏阴性机会性致病菌，广泛分布于环境中，是导致呼吸机相关性肺炎、导管相关尿路感染等医院获得性感染的主要病原之一。该病原体每年在美国造成超过50,000例医院感染，而在中国，24.9%的临床分离株对亚胺培南（针对该病原体的最后一道防线抗生素）耐药。其通过产抗生素灭活酶和形成生物膜等机制获得适应性耐药，日益限制了治疗选择，对公共卫生构成重大威胁。

噬菌体因其高特异性、易于基因改造、理想的稳定性和低生产成本，已被广泛用作构建细菌检测技术的有效识别元件。然而，基于全噬菌体的检测技术面临两个根本性局限：其一，其固有的裂解活性会在检测过程中降解宿主细菌，不仅影响定量准确性，还对探针-细菌孵育时间施加了严格限制；其二，其狭窄的宿主范围（通常仅能识别约10%的测试菌株）在应用于多样化临床分离株时可能导致假阴性结果。因此，开发一类具有广谱结合能力且不裂解的新型识别元件，成为推进细菌检测方法发展的关键需求。

图1. 基于Gp47的磁隔离与荧光检测技术用于铜绿假单胞菌的示意图

噬菌体PAB1分离鉴定与Gp47生物信息学解析：从废水到重组蛋白的完整技术路线

以铜绿假单胞菌PAJB02为宿主，从西南大学医院废水样本中分离出噬菌体PAB1。通过双层琼脂法反复噬斑纯化获得克隆株，经PEG沉淀浓缩噬菌体颗粒，蛋白酶K-SDS裂解后提取基因组DNA。透射电镜显示PAB1具有直径约75 nm的二十面体头部和长约125 nm的可收缩尾部，符合有尾噬菌体目（Caudovirales）特征。其最佳感染复数（MOI）为0.1，一步生长曲线显示潜伏期约20分钟、上升期约70分钟、90分钟后达到平台期。PAB1在pH 5.0–10.0及40°C以下保持稳定，为后续规模化扩增和尾丝蛋白生产提供了实践基础。

重组Gp47蛋白表达复性与功能验证：广谱结合与无裂解活性的双重突破

功能验证通过噬斑试验和细菌活力试验双重确认。在双层琼脂平板上，天然噬菌体PAB1产生清晰的裂解噬斑，而Gp47未引起可见裂解；细菌活力试验进一步证明，与Gp47孵育2小时后铜绿假单胞菌活菌数与PBS对照组无显著差异，而PAB1处理组细菌存活率急剧下降。这些结果证实重组蛋白Gp47保留了与宿主细菌的结合能力，但不引起细胞裂解。结合谱评估采用包含30株代表不同多位点序列分型（MLST）的临床分离株的面板进行。FITC标记的Gp47与所有30株分离株孵育后，荧光显微镜观察显示Gp47识别了全部测试菌株，确认其广谱结合能力。这一特性有效克服了全噬菌体宿主范围狭窄的瓶颈。

关键发现

1、从医院废水分离的噬菌体PAB1经基因组测序鉴定尾丝蛋白Gp47，重组表达后获得约97 kDa可溶性蛋白，产量达1.1 mg/mL。

2、Gp47完全缺乏裂解活性，同时展现广谱结合能力，识别全部30株测试临床分离株，有效克服了全噬菌体检测技术的两大固有缺陷。

3、基于Gp47-MBs和FITC-AMP的三明治荧光检测方法线性范围为3.2×10²–3.2×10⁶ CFU/mL，检出限10⁹ CFU/mL，在生理盐水、尿液和奶粉等复杂基质中回收率71.23%–110.87%。

未来展望与应用潜力

该研究为噬菌体衍生蛋白在病原菌诊断中的应用开辟了新路径。重组尾丝蛋白策略可推广至其他多重耐药革兰氏阴性病原体，通过系统挖掘广谱结合蛋白，构建下一代细菌诊断平台。Gp47作为高性能识别元件，不仅可直接用于荧光检测，还可适配侧向层析、电化学生物传感器等多种检测模式，满足不同场景下的诊断需求。研究团队指出，未来需在更大规模的临床样本中验证该方法的性能，并探索Gp47与LPS受体的精确结合机制以指导蛋白工程改造。随着全球噬菌体治疗项目的推进和噬菌体基因组数据的积累，这种基于受体结合蛋白的识别元件开发策略，有望为感染性疾病的快速诊断和抗生素耐药性防控提供切实可行的技术支撑。

参考来源：Yang H, Liao Q, Chen K, et al. Recombinant phage tail fiber protein Gp47 enables broad-spectrum fluorescent detection of Pseudomonas aeruginosa strains[J]. Analytical Chemistry, 2026, 98: 13761-13769. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c00966.