背景知识

牛流行热（Bovine Ephemeral Fever, BEF）是一种由库蠓和蚊媒传播的虫媒病毒病，近年来在亚太地区暴发频率显著增加，给养牛业造成严重的经济损失。当前防控策略主要依赖市售灭活疫苗，但该类疫苗存在个体超敏反应、免疫后产奶量下降及效力不稳定等问题，且病毒在细胞培养中的适应过程可能导致抗原表位改变。BEFV的糖蛋白（G蛋白）是病毒表面主要的中和抗原与保护性抗原，已被证实可诱导保护性免疫应答。相较于昆虫细胞系统，哺乳动物细胞表达系统能够产生含有末端唾液酸的复杂N-糖基化修饰，更真实地模拟天然病毒蛋白的抗原结构，从而更有效地激发保护性免疫。然而，重组G蛋白在哺乳动物细胞中的低产量以及牛模型实验获取的困难，导致自1996年以来鲜有研究直接评估哺乳动物细胞来源的G蛋白亚单位疫苗在牛体内的效力，本研究正是针对这一空白展开的探索。

图 牛流行热病毒（BEFV）糖蛋白（G蛋白）功能位点分布示意图

研究方法

研究团队基于2024年台湾暴发株（与GenBank OP887034.1序列高度相似）设计了四种重组蛋白：包含完整外结构域的r521（13–521 aa）和r510（13–510 aa），以及在其N端重新插入分泌信号肽的s521和s510。所有构建均保留G1–G4四个中和位点及第175、264、416、438、507位五个糖基化位点，并通过pcDNA 3.4载体在ExpiCHO表达系统中进行表达。蛋白经镍柱亲和层析纯化及30K超滤浓缩后，通过SDS-PAGE和抗His标签Western blot验证。基于产量（s510达30 mg/L）和纯度（约80%）的评估，最终选定s510与MONTANIDE ISA 206 VG佐剂按1:1比例配制亚单位疫苗（每剂150 μg）。实验采用3头荷斯坦牛作为免疫组、3头作为对照组（sham），分别于第0、14、28天经颈部皮下接种。每周采集血清，通过BHK-21细胞中和试验测定抗体滴度；利用SYBR Green实时PCR检测IL-4、IL-10、IL-12B、IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平；同时建立TaqMan实时PCR体系监测BEFV核酸，以排除自然感染干扰。组间差异采用Wilcoxon双样本检验进行统计分析。

研究结果

在四种重组蛋白中，r510、r521和s510成功表达并呈现约70 kDa的预期条带，而s521产量低于10 mg/L，不适用于后续疫苗开发。蛋白定量分析表明，s510的产量和纯度最高，因此被选为疫苗抗原。动物免疫结果显示，接种组牛只的中和抗体滴度在第42天（第三剂接种后两周）达到峰值，平均较基线提升35倍，且在第28、35、42和49天与对照组存在显著差异（p < 0.05）。细胞因子分析发现，IFN-γ基因在接种后第7天和第21天出现显著上调（与接种时间点相对应），提示疫苗有效刺激了细胞免疫应答；而IL-4、IL-10、IL-12B和TNF-α的表达水平在两组间无显著差异。安全性方面，仅免疫组中的一头牛出现轻微的局部肿胀（2 cm × 3 cm），未观察到其他局部或全身不良反应。此外，除对照组一头牛在一次重复检测中出现Ct值为39.8的极弱阳性信号外，所有样本的BEFV核酸检测均为阴性，证实了实验结果未受自然感染干扰。

结论与意义

本研究证实，CHO细胞表达的截短型BEFV G蛋白s510是一种具有良好应用前景的亚单位疫苗候选抗原，能够在牛体内诱导高水平的中和抗体应答并显著上调IFN-γ表达，提示其可同时激活体液免疫与细胞毒性免疫通路。该研究填补了近年来缺乏哺乳动物细胞来源重组G蛋白在牛模型中系统评估的空白，为BEFV亚单位疫苗的产业化开发提供了关键数据支持。根据文献报道，中和抗体滴度高于1:32即可对BEF感染提供有效保护，本研究达到的抗体水平已满足这一保护阈值。然而，研究也存在样本量较小（每组仅3头牛）的局限性，未来需在更大规模的牛群中开展现场试验及病毒攻毒保护试验，以进一步验证疫苗的田间效力；同时还需优化疫苗稳定性、探索更低有效剂量及更适配的佐剂方案，从而推动该候选疫苗向实际应用转化。

参考来源：Hsu, H.-Y.; Yeh, S.-J.; Chen, C.-C.; Ke, G.-M. CHO Cell-Produced Truncated Bovine Ephemeral Fever Virus Glycoprotein as a Promising Subunit Vaccine Candidate for Cattle. Vaccines 2026, 14, 265. https://doi.org/10.3390/vaccines14030265