告别血清乱象！无血清肾细胞模型，破解药物肾毒筛查困境！

研究背景

胎牛血清取自未发育完全的牛胚胎，长期遭到国际动物保护组织抗议。同时，受国际贸易、畜牧产业波动影响，胎牛血清价格持续上涨、供应短缺，欧美多国已出台政策，强制推动科研与产业界替代、减少胎牛血清使用。且胎牛血清成分未标准化，不同厂家、不同批次组分差异极大，是造成全球生命科学领域细胞实验结果无法重复的核心诱因之一。而过往针对肾近端小管细胞的无血清培养尝试，普遍存在两大缺陷：一是无法支持细胞长期传代（仅可维持1-2代），难以满足长期药物筛选需求；二是会大幅破坏OAT1等关键药物转运体的表达与功能，让细胞模型丧失药物检测价值。此外，前沿的3D生物工程肾小管、肾脏器官芯片，始终缺乏成熟的无血清培养方案，限制了高端肾脏体外模型的产业化落地。欧盟、美国FDA 等监管机构大力推荐3R原则（替代、减少、优化动物实验），鼓励用人源细胞模型、类器官替代动物开展药物毒理检测。在此背景下，开发成分可控、生理相关、功能稳定的无血清人肾细胞培养体系，成为药物研发、再生医学领域的紧迫需求。

研究方法

基础培养基与实验细胞准备：选用合规来源的ciPTEC-OAT1细胞（取自健康人尿液，稳定表达OAT1转运体）作为实验对象，选用传代50~60代的细胞开展实验。其中对照组培养基（FCS 培养基）以DMEM-F12为基础，添加10%胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、表皮生长因子、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸；实验组基础无血清培养基以Advanced DMEM-F12为基底，搭配GlutaMAX、HEPES、表皮生长因子、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸；后续添加不同类型、浓度的人血小板裂解物（hPL）、肝素、B27 等添加剂进行配方优化。

2D平面细胞培养与基础功能验证：先进行初代成熟培养实验：将细胞接种至24孔板，33℃培养24h后，替换为FCS培养基或多款配方的无血清培养基，37℃成熟培养7天。采用PrestoBlue试剂检测细胞活力，BCA法测定细胞总蛋白含量；通过荧光素摄取实验 + 丙磺舒抑制实验，验证OAT1转运体的功能活性。然后进行细胞外基质适配测试：将细胞提前4天适应无血清环境，分别采用不同细胞外基质包被培养板，重复细胞活力、蛋白定量、OAT1功能检测，评估基质对无血清培养细胞的影响。最终通过长期传代筛选实验确定最优配方：设置 1%/5%/10% ELAREMTM Prime、1% ELAREMTMPerform等不同浓度hPL的无血清组别，与FCS对照组同步连续传代5代以上。定期计数细胞、显微观察细胞形态，筛选可支持长期增殖的最优无血清配方。

转录组与药物转运体蛋白分析：转录组测序是将细胞分别在最优无血清培养基、FCS 培养基中培养1代、5代，提取细胞总RNA，利用Illumina NextSeq2000平台完成测序。使用iDEP软件分析差异基因，结合KEGG、GO数据库开展通路富集分析。转运体蛋白定量是采用IV型胶原包被培养细胞，裂解细胞后通过靶向质谱蛋白质组学，定量检测OAT1、P-gp、MRP4、BCRP等临床核心药物转运体的蛋白丰度。

细胞生物能特征检测：采用Seahorse XF线粒体压力测试，在XF96孔板设置多种细胞接种密度，检测细胞氧气消耗率（OCR）、胞外酸化率（ECAR），量化基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力等线粒体功能指标。以细胞总蛋白含量校准所有生物能数据，对比无血清组与 FCS组的代谢表型差异来进行数据标准化。

3D生物工程肾小管（中空纤维膜HFM）优化实验：先进行模型构建：选用内径320μm的中空纤维膜，灭菌后进行基质包被；将扩增后的ciPTEC-OAT1接种至膜表面，33℃增殖培养后转入37℃成熟培养。再进行hPL浓度梯度优化：设置 1%、5%、10% hPL无血清组别及FCS对照组，检测细胞代谢活性，通过鬼笔环肽、DAPI荧光染色观察细胞在膜表面的覆盖完整性。最后进行基质与动态培养测试：测试层粘连蛋白、IV型胶原等基质组合的培养效果；增设摇摆动态培养组，对比静态、动态环境下3D肾小管的细胞活力与形态。

统计学分析：使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析：组间差异采用单/双因素方差分析，多重比较选用Dunnett、Bonferroni校正；两组对比采用非配对t检验；转录组数据以FDR＜0.05作为差异基因筛选阈值。

研究结论

无胎牛血清（FCS-free）培养体系构建与细胞增殖：无血清培养基可支撑细胞成熟，细胞活力稳定，但细胞密度与 OAT1 转运活性下降（图 1）。

细胞活力与核心药物转运体（OAT1）功能：1% ELAREMTM Perform 人血小板裂解物（hPL）可实现细胞长期传代（≥5 代）（图 2）。

转录组、信号通路与细胞表型：无血清培养重塑细胞转录组，炎症、缺氧通路下调，黏附与药物转运通路上调（图 3）。

细胞生物能量代谢：无血清培养导致OAT1表达与功能大幅降低，外排型药物转运体表达显著升高（图 4）。

3D 生物工程肾小管（中空纤维膜模型）培养：无血清体系显著提升细胞生物能量代谢，代谢表型更贴近人体原生肾细胞（图 5）。

技术优势：提升hPL浓度可优化3D生物工程肾小管，动态培养进一步强化细胞活性。无血清体系中10% hPL组细胞代谢活性较1%组提升2.1倍，细胞可在中空纤维膜表面形成连续完整的细胞层，接近FCS组水平；摇摆动态培养可让细胞代谢活性再提升19%，达到FCS组的85%（图 6-图 7）。

结论与展望

本研究成功建立了以人血小板裂解物（hPL）为核心添加剂的ciPTEC-OAT1无胎牛血清培养体系，该体系可同时适配2D单层细胞与3D生物工程肾小管模型。相较于传统FCS培养体系，无血清模型细胞炎症水平更低、线粒体生物能更强、代谢表型更贴合人体原生肾脏细胞；缺陷在于核心摄取转运体OAT1表达与功能下降，外排转运体表达上调。该体系兼顾伦理、实验重复性与生理相关性，可应用于线粒体毒性、代谢相关药物筛查，也为3D肾脏类器官、生物人工肾研发提供了新平台。本成果无需牛源原料，同时优化的人源细胞模型可进一步减少药物研发中的动物使用。“血清替代 + 人源细胞模型”是药物毒理检测的两大主流方向，二者结合能形成完整的合规化解决方案，尤其适合面向欧美市场的药企布局。目前，广东环凯微生物科技有限公司已有较为成熟的胎牛血清产品，规格在50-500mL范围不等。可用于敏感细胞系培养、细胞学验证、抗体药物开发、小鼠胚胎干细胞培养、杂交瘤细胞培养、昆虫细胞培养、病毒包装。

参考文献链接：https://doi.org/10.1007/s00441-026-04072-7