原核表达PPV VP2病毒样颗粒诱导长寿浆细胞与记忆B细胞应答：一种优于传统灭活疫苗的下一代候选疫苗

背景知识

猪细小病毒（PPV）是导致母猪繁殖障碍（如胎儿死亡、木乃伊胎）的重要病原体，一旦感染猪场便极难根除，且病毒衣壳蛋白持续变异使现有疫苗面临免疫逃逸风险。PPV的VP2蛋白是主要衣壳蛋白与免疫保护性抗原，可在体外自组装为不含病毒核酸的VLP，既保留天然病毒的空间构象与血凝活性，又具备优异的安全性。体液免疫是抵御PPV的核心机制，高滴度中和IgG可有效阻断病毒感染；而抗体的亲和力成熟与长期维持依赖于生发中心反应，其中B细胞在Tfh细胞提供的IL-21、CD40L等信号支持下完成增殖、体细胞高频突变与类别转换，最终分化为LLPCs和MBCs。ISA 201VG是一种水包油包水（W/O/W）双相乳剂佐剂，可通过抗原缓释与促进抗原呈递细胞摄取来增强GC反应。尽管前期研究已证实分子伴侣Tf16辅助表达的PPV VP2 VLP具有高免疫原性，但其能否通过激活GC-Tfh轴诱导长期免疫记忆尚缺乏系统研究。

图 小鼠免疫方案及样本采集示意图。

研究方法

研究采用大肠杆菌BL21(DE3)共表达pET28a-PPV-VP2与pTf16伴侣质粒，经低温诱导、Ni2+-NTA亲和层析纯化获得VP2蛋白，并通过透射电镜（TEM）与血凝试验验证VLP的自组装形态与生物活性。动物实验选用6周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为PBS阴性对照组、商业灭活疫苗阳性对照组及VLP+ISA 201VG佐剂组，按0、2、4周程序皮下免疫3次，持续采血至22周。检测指标包括：ELISA测定血清PPV特异性IgG及其亚类（IgG1、IgG2a）；血凝抑制（HI）试验评估中和抗体水平；ELISA检测脾淋巴细胞再刺激后分泌的IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子；FITC标记VLP用于抗原特异性细胞示踪；流式细胞术定量分析骨髓BMPCs（B220⁻CD138+）、脾脏及淋巴结中的GC B细胞（B220⁺GL7⁺CD95⁺）、Tfh细胞（CD3⁺CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）、抗原特异性LLPCs（CD138⁺B220⁻CD19⁻VLP⁺）和MBCs（IgD⁻CD19+CD38+GL7⁻VLP+）；激光共聚焦显微镜观察淋巴结GC组织结构；RT-qPCR检测GC形成与B细胞分化相关转录因子（Bcl-2、Irf4、Prdm1、Pax5、Bach2）及Il21的mRNA表达；并利用10x Genomics平台对淋巴结免疫细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），解析VLP免疫后的细胞组成与分子通路。最后，在初次免疫后第42天以PPV-7909攻毒，通过绝对定量qPCR检测脾脏病毒载量以评估保护效力。

研究结果

实验成功获得高纯度、可自组装为球形颗粒并具有血凝活性的PPV VLPs。免疫动力学显示，VLP组血清IgG反应启动更早，且在整个22周观察期内维持显著高于灭活疫苗组的滴度；第56天IgG1与IgG2a水平均显著升高，IgG1/IgG2a比值大于1，呈现Th2偏倚但兼具Th1应答的均衡细胞因子谱（IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ均显著升高）。HI抗体结果与IgG趋势一致，VLP组产生更强效且持久的中和抗体。在细胞层面，VLP组骨髓中BMPCs比例显著增加；淋巴结GC结构在共聚焦下清晰可见且B220⁺GL7⁺区域丰富，而灭活疫苗组稀疏、PBS组缺失。流式分析证实，VLP组脾脏与淋巴结中GC B细胞及Tfh细胞频率均显著高于对照组；同时，抗原特异性LLPCs（骨髓）和MBCs（脾脏）数量也显著增多，表明VLP成功驱动了GC输出与长期体液记忆。分子机制上，VLP组淋巴结中Bcl-2、Irf4、Prdm1（Blimp-1）和IL-21表达显著上调，而Pax5与Bach2下调，符合GC B细胞向浆细胞命运分化的转录程序。scRNA-seq进一步揭示，VLP免疫重塑了淋巴组织微环境：B细胞与浆细胞比例增加，GC相关亚群富集；GC B细胞中增殖与激活标志基因（Mki67、Top2a、Sdc2、Sypl、Apobec1）显著上调，而抑制性基因（Nr4a1、Nfkbia）下调；KEGG通路富集显示BCR信号、TCR信号、抗原加工呈递及TNF信号通路显著激活；GO分析提示免疫系统过程、T细胞分化、TLR4信号和干扰素反应等生物学过程增强。攻毒保护实验中，VLP组小鼠脾脏病毒载量显著低于灭活疫苗组，且与免疫前HI滴度呈负相关，证明其可转化为更优的功能性保护。

结论与意义

本研究证实，基于大肠杆菌表达系统与分子伴侣辅助制备的PPV VP2 VLP疫苗，通过其高度重复、模拟天然病毒的空间结构，配合ISA 201VG佐剂，可高效激活GC-Tfh-浆细胞轴，促进抗体亲和力成熟与长期免疫记忆建立，在抗体持久性、GC反应强度及攻毒保护效力上均优于传统灭活疫苗。单细胞转录组分析首次在分子层面阐明了VLP诱导GC B细胞增殖激活与TNF/BCR信号通路协同的免疫学基础，为设计更高效、更安全的PPV下一代疫苗提供了理论依据与实验支撑。然而，研究也存在局限性：缺乏佐剂单独对照与非佐剂VLP组，难以完全区分VLP固有免疫原性与佐剂效应；小鼠并非PPV自然宿主，结论向猪等靶动物的转化仍需在豚鼠及猪模型中进一步验证；此外，scRNA-seq未纳入灭活疫苗组，限制了两组在单细胞分辨率下的直接机制对比。未来研究应聚焦于天然宿主的攻毒验证、交叉株保护评估以及利用VP2 VLP作为多价抗原呈递平台展示其他病原体表位的可行性探索。

参考来源：Hao C, Ma Z, Li J, Qiao X, Chen M, Wang J, Li Y, Yao B, Zhang J, Yang Q, Chen P, Jiang D and Ji P (2026) Porcine Parvovirus virus-like particle vaccine induces long-term humoral immunity by recruiting T follicular helper and germinal center B cell responses. Front. Immunol. 17:1817304. doi: 10.3389/fimmu.2026.1817304.