研究背景

非洲猪瘟（ASF）是 WOAH 法定必报烈性猪出血病，致死率近 100%，1921 年首次在肯尼亚发现，2007 年基因 Ⅱ 型毒株从高加索扩散至欧亚大陆，2018 年传入我国后造成国内生猪产能断崖式下跌，经济损失巨大。2021 年后我国陆续检出基因 Ⅰ 型、自然基因缺失变异株、基因 Ⅰ/Ⅱ 重组毒株，疫病防控复杂度持续攀升。ASFV 为大型双链 DNA 病毒，基因组编码 160~175 个开放阅读框，多数蛋白毒力与免疫逃逸功能尚不清晰，目前全球无商业化安全有效疫苗，生物安全隔离、扑杀仍是主流防控手段，研发安全、高效减毒活疫苗是破局关键。减毒活疫苗可同时诱导体液、细胞免疫，是现阶段最具前景的技术路线，但单基因敲除毒株普遍存在减毒不彻底、保护力不足、抗体依赖增强（ADE）等缺陷，亟需筛选多基因协同敲除的安全靶点组合。

CD2v（EP402R）是 ASFV 关键免疫抑制蛋白，介导红细胞吸附、抑制 cGAS-STING 通路阻断 Ⅰ 型干扰素产生；A137R 晚期表达衣壳蛋白，通过自噬降解 TBK1 抑制干扰素分泌，且抗 A137R 抗体可介导 ADE 效应，加重巨噬细胞病毒感染。单独敲除 A137R 可实现部分减毒，但病毒血症持续时间长；单独敲除 CD2v 在不同毒株中减毒效果差异极大，在国内流行基因 Ⅱ 型 HLJ/18 毒株中单缺 CD2v 仍会造成仔猪高热死亡，仅单一基因删除无法兼顾完全减毒与充足免疫原性。已有研究证实双 / 多基因联合敲除可叠加减毒效果，但尚未验证 CD2v 与 A137R 同步缺失的体内安全性、保护效力与免疫激活机制，本研究填补该靶点组合的评价空白。

研究结果

（一）双基因缺失毒株 HuBΔCD2vΔA137R 成功构建与体外鉴定

研究选用国内流行基因 Ⅱ 型强毒株 HuB/HH/2019 为亲本，搭建携带 LoxP 位点、p72 启动子驱动 eGFP/mCherry 荧光标记的重组质粒，联合 CRISPR/Cas9 提升同源重组效率，在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中构建 CD2v、A137R 同步敲除突变株，通过有限稀释纯化阳性荧光病毒。PCR、全基因组测序证实无野生型病毒污染；红细胞吸附试验显示双缺失株完全丧失血吸附活性，印证 CD2v 功能失活；体外生长曲线与转录组检测表明，双基因敲除不显著影响病毒在 PAMs 中的复制能力，但相较野毒可显著上调巨噬细胞干扰素、炎症相关免疫通路，先天免疫激活更强。

图 1 双基因缺失突变株构建与体外鉴定

（二）动物安全性评价：毒株高度减毒，仔猪无重症、病毒血症快速清除

动物试验分组：4 头仔猪免疫 10⁵ TCID₅₀ HuBΔCD2vΔA137R（V 组），2 头空白对照（C 组），连续 27 天监测体温、临床症状、病毒血症与排毒。全部免疫仔猪无超过 40.5℃高热，仅 2 头出现 13~15 日龄短暂轻微食欲下降，2~3 天自行恢复；病毒血症 7 dpi 达峰值，24 dpi 完全清除；口腔、肛门拭子病毒载量全程维持极低水平，27 dpi 剖检各脏器病毒载量极低，肺、肾、淋巴结无严重病理损伤，仅见轻微肺泡出血、少量炎性浸润，证明该双缺失株体内安全性优异。同时免疫 7 dpi 即可检出 p30 特异性 IgG 抗体，21 dpi 抗体滴度稳定维持高位，具备良好体液免疫诱导能力。

图 2 双缺失毒株仔猪体内减毒特性试验结果

（三）同源强毒株攻毒保护试验：免疫仔猪 100% 存活，无临床发病

免疫 27 dpi 对 V 组存活 3 头仔猪、C 组 2 头对照猪肌肉注射 10² HAD₅₀亲本强毒株 HuB/HH/2019 攻毒，连续 22 天监测。对照组 2 头仔猪分别于 7、11 dpc 全部死亡，全程持续高热、精神沉郁、皮肤发红、呼吸困难，剖检可见典型 ASF 严重病变：脾脏肿大梗死、肝肾充血出血、扁桃体肿胀淤血。全部免疫仔猪全程体温正常，无任何 ASF 临床症状；血液、拭子野毒载量极低或完全检测不到，仅 1 头仔猪脏器检出微量野毒；病理切片仅见肺泡轻度间质增生、少量淋巴结炎性浸润，无脏器坏死、梗死等特征性病变，p30 抗体维持高水平不显著升高，证明免疫形成稳定、长效保护屏障，可阻断强毒株在体内大量复制与扩散。

（四）转录组与细胞因子揭示温和且完整的免疫应答

对免疫仔猪外周血单核细胞（PBMC）开展 RNA-seq，3 dpi 启动 PI3K-Akt、白细胞跨内皮迁移通路，7 dpi 全面激活 Toll 样受体、RIG-I 样受体、抗原递呈、B 细胞受体等先天 + 适应性免疫通路。细胞因子检测显示，双缺失株仅诱导温和炎症反应，无 IL-6、IFN-α/β 等关键因子风暴，炎症相关基因短暂上调后快速回落，维持机体免疫稳态；同时干扰素刺激基因（ISGs）显著上调，印证 CD2v、A137R 双缺失解除病毒对干扰素通路的双重抑制，是毒株快速激活免疫、实现高效保护的核心分子机制。

总结与展望

本研究首次系统证实CD2v 与 A137R 同步敲除可实现基因 Ⅱ 型 ASFV 毒株完全减毒，HuBΔCD2vΔA137R 兼具高安全性与完全同源攻毒保护力，同时规避单基因缺失毒株存在的毒力残留、ADE 风险、免疫激活不足等短板，明确 CD2v/A137R 是适配国内流行基因 Ⅱ 型毒株的优质疫苗靶点组合，为 ASF 减毒活疫苗研发提供全新改造策略。现有研究仍存在局限：试验仅开展同源毒株攻毒，未评估对基因 Ⅰ 型、重组变异株的交叉保护效力；动物样本量偏少，缺乏大群规模化免疫安全性验证；毒株荧光标记序列尚未切除，后续需去除报告基因优化 DIVA 鉴别诊断体系。未来研究将从三方面推进：一是在此双缺失基础上额外敲除毒力基因进一步提升减毒程度，降低疫苗残留复制风险；二是开展异源毒株攻毒、仔猪 / 母猪不同日龄动物试验，验证广谱保护与群体安全性；三是优化毒株细胞培养工艺、建立 DIVA 检测配套试剂盒，推进候选疫苗临床前评价，为非洲猪瘟商业化疫苗开发提供重要支撑。

来源：Peng G, Zhao X, Zou X, Zhang H, Zhao J, Zuo X, Tan S, Wu R, Guan X, Li S, Xu Y, Xia Y, Xu X, Xu L, Zhu Y, Liu J, Liu Y, Gao GF.2025.An attenuated African swine fever virus with deletions of the CD2v and A137R genes offers complete protection against homologous challenge in pigs. J Virol99:e00262-25.https://doi.org/10.1128/jvi.00262-25