狂犬病毒“变身”三合一疫苗大巴：搭载CDV和CPV抗原，一针开启三重免疫护盾

在犬类传染病谱系中，狂犬病（Rabies）、犬瘟热（CD）和犬细小病毒病（CPV）堪称“三座大山”。狂犬病以近乎100%的病死率和人兽共患特性高居公共卫生关注榜首；犬瘟热病毒（CDV）引发全身性感染，免疫抑制与神经症状让治疗极为棘手；犬细小病毒2型（CPV-2）则以其极高的环境稳定性和对幼犬的高致死率，令全球兽医焦头烂额。更令人担忧的是，这三种病毒在临床中常出现混合感染，使得单病种疫苗需要多次、分别接种，不仅增加了管理成本，也延迟了全面免疫保护的形成。

图 1 重组病毒rHEP-Flury（H+VP2）的鉴定

有没有一种可能-只打一针，就能同时激活针对这三种致命病毒的免疫屏障？近日发表于《The Veterinary Journal》的一项创新研究给出了肯定的答案。来自华南农业大学等机构的研究团队，利用成熟的狂犬病毒反向遗传操作系统，成功构建了一株重组狂犬病毒 rHEP-Flury(H+VP2) ，它同时携带着犬瘟热病毒的H基因和犬细小病毒的VP2基因。经灭活后，这款“三合一”候选疫苗在小鼠体内同时诱导了针对狂犬病毒、CDV和CPV的高水平中和抗体，并激活了平衡的Th1/Th2细胞免疫应答。这一成果为犬类多联疫苗的开发开辟了一条全新的技术路径。

为何选择狂犬病毒作“大巴”？-载体的天然优势

活病毒载体疫苗是当前疫苗学的研究热点，其核心思路是将一种安全、稳定的病毒改造成“基因运输工具”，搭载其他病原体的保护性抗原基因。狂犬病毒（RABV）凭借其独特的生物学特性，在这一领域表现尤为突出：其基因组结构简单（约12 kb，编码5种结构蛋白），且已被证明对外源基因具有较高的包容性和表达效率。更重要的是，狂犬病毒载体可在不破坏自身免疫原性的前提下，诱导强烈的体液和细胞免疫应答。

本研究选用的HEP-Flury株是经典的狂犬病毒减毒株，已在全球范围内作为疫苗株使用多年，安全性有充分保障。研究团队在其G蛋白和L蛋白基因之间插入了一个“双基因表达盒”-依次为CDV的H基因和CPV的VP2基因，两者均配备独立的转录起始和终止信号。这一设计确保了外源基因能够在病毒复制过程中独立、高效地转录和表达。

构建与验证：插入3.7 kb外源基因，病毒依然“稳如磐石”

重组病毒的“拯救”是决定成败的第一步。研究团队将构建好的全长基因组质粒与辅助质粒（N、P、G、L蛋白）共转染BHK-21细胞，通过免疫荧光和RT-PCR确认了重组病毒rHEP-Flury(H+VP2)的成功获得。Western blot、间接免疫荧光和质谱鉴定进一步证实，CDV H蛋白和CPV VP2蛋白均得到正确表达。

一个关键问题是：插入总长达3.7 kb的外源基因，会不会让狂犬病毒“不堪重负”？研究团队对此进行了严格评估。他们将重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次，并在第1、5、10、15、20代分别进行RT-PCR和测序-结果显示，所有传代均未检测到基因缺失或突变，遗传稳定性极佳。值得一提的是，在病毒拯救过程中确实出现过约1 kb的VP2基因缺失变异株，但这些变异株并未在后续传代中持续出现，提示其与病毒复制本身无关，更可能与拯救初期的重组事件有关。

在生长动力学方面，重组病毒的复制曲线与亲本株HEP-Flury高度一致，均在感染后72小时达到滴度峰值；虽然重组病毒的峰值滴度略低，但差异未达统计学显著水平。这表明，即使同时搭载两个外源基因，狂犬病毒载体的复制能力依然保持良好。

图 2 中和抗体检测

免疫效果：“一针三防”不是梦，中和抗体齐登场

为了评估该重组病毒的免疫原性，研究团队将其灭活后，辅以Montanide™ Gel 01佐剂，对小鼠进行了三次肌肉注射免疫（0、21、42天）。在首次免疫后14天、35天和56天分别采血检测中和抗体，结果令人振奋：

狂犬病毒：首次免疫后14天，所有免疫小鼠的中和抗体滴度即超过世界卫生组织（WHO）推荐的保护阈值0.5 IU/mL，表明RABV自身免疫原性保持良好。

犬瘟热病毒：经过三次免疫后，80%（4/5）的小鼠CDV中和抗体滴度超过1:32-该滴度被多项研究视为CDV的有效保护水平。

犬细小病毒：CPV中和抗体的平均滴度为1:13，相对较低。研究团队分析认为，这可能与VP2蛋白在重组病毒中的表达水平或固有免疫原性有关，后续可通过优化基因插入位置或表达调控元件加以提升。

值得注意的是，尽管CPV抗体滴度不算突出，但所有免疫小鼠均能同时产生针对三种病毒的特异性抗体，证明了该载体“一价激发三价应答”的可行性。

细胞免疫：Th1/Th2“双轮驱动”，筑牢抗病毒根基

中和抗体虽关键，但细胞免疫在清除病毒和建立长期免疫记忆中同样不可或缺。为评估重组疫苗能否激活T细胞应答，研究团队在末次免疫后分离了小鼠脾淋巴细胞，分别用灭活的RABV、CDV和CPV进行体外刺激，检测培养上清中的IFN-γ和IL-4水平。

结果显示：与PBS对照组相比，免疫组小鼠的脾细胞在受到任何一种抗原刺激后，IFN-γ和IL-4均显著升高。IFN-γ是Th1型免疫应答的标志性细胞因子，在抗病毒免疫中发挥核心作用；IL-4则代表Th2型免疫，辅助B细胞产生抗体。这一“双阳性”结果表明，rHEP-Flury(H+VP2)灭活疫苗能够诱导平衡的Th1/Th2混合型免疫应答-既有助于清除病毒感染的细胞，又有助于产生高亲和力抗体。

研究团队指出，灭活病毒单独免疫通常难以激活强烈的细胞免疫，本研究中观察到的Th1应答，很可能归功于Montanide™ Gel 01佐剂的协同增效作用，也与三次加强免疫的累积效应密不可分。

展望：从实验室到临床，仍需跨越哪些门槛？

本研究首次证明，以狂犬病毒为载体、同时表达CDV H和CPV VP2的重组灭活疫苗，可在同一动物体内激发针对三种核心犬类传染病原体的特异性免疫应答。其优势显而易见：

一针三防，极大简化免疫程序，提高依从性；

采用灭活形式，规避了减毒活疫苗潜在的残余毒力、排毒和返祖风险；

狂犬病毒载体本身兼具优异的遗传稳定性和高表达效率。

当然，该研究仍处于小鼠模型的概念验证阶段，后续向犬类临床应用的转化仍需解决几个关键问题：一是优化CPV VP2的表达效率或免疫原性，提升其诱导的中和抗体滴度；二是评估该重组疫苗在犬体内的保护效力-中和抗体的存在不等于完全保护，攻毒保护实验将是下一步的“试金石”；三是探索能否将该平台拓展至其他犬类病原体（如犬腺病毒、犬副流感病毒等），打造更广谱的“多联多价”疫苗库。

总而言之，这项研究不仅为我们提供了一种“一箭三雕”的犬类疫苗新策略，更再次彰显了狂犬病毒反向遗传系统作为疫苗载体的巨大潜力。在不远的将来，我们或许真的能看到这样一种场景：宠物医院里，兽医只打一针，便为狗狗筑起了抵御三大致命病毒的坚实防线。

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参考资料：

Yan Z, Li B, Peng J, Li X, Wu Y, Liu X, Chu Y, Huang S, Luo J, Guo X. Immunogenic evaluation of a recombinant rabies virus expressing canine distemper virus H gene and canine parvovirus VP2 gene. Vet J. 2026;317:106654.