CRISPR 改造展示 LL37 的工程噬菌体，高效防控多重耐药沙门氏菌

一、研究背景

多重耐药鼠伤寒沙门氏菌 DT104 是典型食源性致病菌，可耐受氨苄西林、四环素等多种抗生素，污染食品后易引发人体肠胃炎，细菌能够侵入肠道上皮细胞并扩散至内脏，严重时造成多器官衰竭。随着抗生素耐药问题持续加剧，传统治疗手段逐渐失效。

噬菌体疗法作为天然替代方案，具有靶向杀菌、不损伤肠道共生菌群的优势，已用于多种耐药菌感染防控。但天然烈性噬菌体存在明显短板：细菌易进化出噬菌体不敏感突变株（BIM）；噬菌体吸附效率有限，裂解后菌体极易二次复长；同时难以有效清除侵入宿主细胞内的沙门氏菌。此外，单独使用游离抗菌肽 LL37 存在生理盐环境易失活、起效浓度高等缺陷。为克服上述局限，本研究利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术改造沙门氏噬菌体，在病毒衣壳表面固定展示人源抗菌肽 LL37，构建具备双重杀菌功能的工程噬菌体，系统评价其体外、细胞及活体抗菌效果。

二、研究内容与结果

研究构建 CRISPR-Cas9 切割质粒与含 LL37 同源臂的编辑质粒，电转入沙门氏菌完成噬菌体基因组同源重组，测序验证得到改造噬菌体 ϕE，野生噬菌体记为 ϕWT。研究从噬菌体理化特性、体外抑菌、肠道细胞防护、昆虫活体保护四个维度开展实验。

图1 野生型与 LL37 改造工程噬菌体的形态、稳定性及侵染生物学特性表征

基础表征结果显示，LL37 修饰不会改变噬菌体头部、尾部形态，二者在 4–37 ℃、pH 3–11 范围内稳定性无差异；改造株细菌吸附率由 70.9% 提升至 95.24%，侵染潜伏期缩短，噬斑面积提升 231.6%，扩散杀菌能力更强。

图2 野生型与 LL37 工程噬菌体长达 72 h 的长效裂解抑菌效果对比

72 h 长效裂解实验证明，所有剂量野生噬菌体处理组 20 h 后细菌大量复长，而 ϕE 在最低感染复数 MOI=0.001 下仍可全程抑制活菌；ϕE 诱导的耐药突变发生率较野生株低一个数量级。耐药菌会丢失鞭毛，运动与细胞侵袭毒力显著下降。

HT29 肠道上皮细胞模型结果表明，ϕE 可显著降低沙门氏菌黏附、入侵与胞内增殖，携带 LL37 的噬菌体空壳同样具备防护效果，且无细胞毒性。大蜡螟体内预防性实验显示，高剂量改造噬菌体可将幼虫存活率提升至 56.7%，远高于野生噬菌体 10% 的保护效率。

机制层面，噬菌体表面高密度富集 LL37，在细菌接触界面形成局部高浓度，快速破坏革兰氏阴性菌外膜；细菌同时面临噬菌体侵染与抗菌肽膜损伤双重选择压力，大幅延缓耐药突变产生。

三、总结

该研究首次实现烈性沙门氏噬菌体衣壳展示 LL37，改造噬菌体完整保留原有理化稳定性，同时提升吸附、裂解效率，长效抑制细菌增殖并降低耐药突变风险。在肠道细胞与大蜡螟模型中，工程噬菌体可有效阻断沙门氏菌侵袭、提升宿主存活率，无明显毒副作用。

研究仍存在一定局限：大蜡螟无哺乳动物完整免疫体系，且未深入解析细菌应对双重胁迫的转录组变化；工程噬菌体临床应用还面临生物安全与法规限制。后续可更换拷贝数更高的 Soc 衣壳蛋白展示 LL37，进一步优化抗菌效果。总体而言，多肽武装型工程噬菌体为多重耐药沙门氏菌的食品生物防控与感染预防提供了安全、高效的全新策略。

参考来源：10.1016/j.ijantimicag.2026.107734