巯基化壳聚糖黏膜黏附型纳米疫苗实现甲型流感广谱防护

研究背景

甲型流感病毒 (IAV) 跨宿主传播、抗原漂移频繁，每年需更新疫苗毒株，传统肌肉注射灭活疫苗仅能诱导循环 IgG，无法在呼吸道黏膜产生分泌型 IgA（sIgA），而呼吸道黏膜是流感入侵第一道屏障，黏膜免疫缺失造成疫苗防护效率有限。M2e、NP 是流感高度保守抗原：M2e 可诱导广谱中和抗体，NP 激活交叉保护性细胞毒性 T 细胞，但二者单独免疫免疫原性极弱，小分子肽易被黏膜清除，难以同时激活体液与细胞免疫，亟需递送载体提升抗原黏膜滞留与抗原提呈效率。

鼻腔免疫可同时激活黏膜、体液、细胞三重免疫，但呼吸道黏液自净作用会快速清除外源抗原，大幅削弱免疫刺激效果。壳聚糖具备生物相容性、生物可降解性与天然黏膜黏附能力，巯基修饰后可与黏液蛋白半胱氨酸形成二硫键，黏附能力提升百倍，还能打开上皮紧密连接、促进抗原提呈细胞吞噬；但巯基取代度会改变壳聚糖电荷、交联效率与细胞毒性，且巯基化壳聚糖 (TCS) 与三聚磷酸钠 (TPP) 交联比例直接影响纳米颗粒包封率、粒径与黏膜黏附性能，目前缺少适配流感 VLP 抗原的最优制备体系，同时缺乏可同时展示 B 细胞表位 M2e、携带 T 细胞表位 NP 的一体化递送平台。

研究结果

双表位 VLP 成功构建，优化巯基化壳聚糖纳米制备工艺，载体安全、黏膜黏附与抗原递送能力突出

研究利用 PCV2 Cap 蛋白自组装特性，将 NP 来源 T 细胞表位连接至 Cap 蛋白内侧 N 端，人、猪、禽三型 M2e B 细胞表位串联在外侧 C 端，构建重组 NCM 蛋白；大肠杆菌表达纯化后的蛋白可自主组装结构均一的 NCM VLPs。借助原文图 1（NCM VLPs 表征图）可见，透射电镜下颗粒直径 25 nm，动态光散射粒径分布均一，Zeta 电位 - 34.4 mV，颗粒水溶液稳定性良好。团队梯度调控 TCS 巯基接枝量与 TCS/TPP 交联比例，筛选出最优工艺：巯基含量 511 μmol/g、TCS:TPP 质量比 5:1，制得 NCM VLPs@TCS 纳米颗粒平均粒径 196 nm、表面带正电，包封率与载药量稳定；黏液吸附实验证实高巯基修饰纳米颗粒黏液结合能力是未改性壳聚糖的 2.2 倍，细胞毒性、红细胞溶血实验证明材料无明显细胞损伤，冻干 4℃长期储存仅轻微聚集；体外细胞吞噬实验证明 TCS 纳米载体可显著提升树突状细胞、巨噬细胞对 VLP 抗原的摄取效率，利于后续抗原呈递与免疫激活。

图1 NCM 病毒样颗粒的理化表征

纳米疫苗诱导全身 + 黏膜双重强效免疫，对人、猪、禽甲型流感实现 100% 交叉保护，阐明双重协同保护机制

小鼠鼻腔三次免疫后，NCM VLPs@TCS 组诱导的血清 M2e 特异性 IgG、IgG1、IgG2a 抗体滴度显著高于游离 VLP、多肽混合对照组，肺部灌洗液中高浓度 sIgA 可广谱结合 H1-H11 全部流感亚型 M2e 序列；细胞免疫层面，疫苗显著上调脾脏 CD4⁺、CD8⁺T 细胞比例，刺激大量 NP、M2e 特异性 IFN-γ 分泌淋巴细胞，同步激活 Th1/Th2 平衡免疫应答。致死攻毒实验中，游离多肽组小鼠全部死亡，游离 VLP 仅提供部分保护；结合原文图 6（人 H1N1 流感攻毒保护结果图）可见，NCM VLPs@TCS 纳米疫苗组小鼠无死亡，体重下降幅度极低，肺部病毒载量大幅降低，肺组织肺泡结构完整、炎症浸润极轻。被动免疫与体内 T 细胞清除实验证实，M2e 特异性抗体与 CD8⁺细胞毒性 T 细胞协同作用是疫苗广谱防护的核心机制，其中 CD8⁺T 细胞对清除病毒、降低肺损伤起到关键作用。

图2 NCM VLPs@TCS 纳米疫苗抗人甲型流感病毒的保护效果

总结与展望

本研究搭建了低成本、可规模化生产的鼻腔通用流感纳米疫苗平台，以大肠杆菌表达双表位 PCV2 病毒样颗粒为抗原骨架，搭配巯基化壳聚糖离子交联黏膜递送系统，系统优化巯基取代度、交联剂配比两大关键工艺，获得理化稳定、生物安全的纳米疫苗。鼻腔给药依托 TCS 强黏膜黏附、促上皮渗透优势，同步诱导呼吸道 sIgA、广谱交叉抗体与多功能 CD4⁺/CD8⁺T 细胞应答，在小鼠模型中对多物种甲型流感致死攻毒实现完全保护，清晰阐明抗体与细胞毒性 T 细胞协同介导的广谱免疫机制，充分验证巯基化壳聚糖在呼吸道黏膜疫苗领域的应用潜力。

后续研究可从三方面推进：一是拓展雪貂、仔猪等大动物模型验证疫苗转化潜力；二是优化 TCS 合成工艺与液体制剂配方，降低生产、储存与给药门槛；三是拓展该递送平台至新冠、呼吸道合胞病毒等其他呼吸道病原体，开发多联黏膜纳米疫苗；同时补充分子互作实验，解析 TCS 与黏液、抗原之间的动态作用机理，完善黏膜纳米载体理论体系。

来源：Thiolated chitosan encapsulation constituted mucoadhesive nanovaccine confers broad protection against divergent influenza A viruses. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121689.