敲除 H240R/MGF505-7R！新型安全非洲猪瘟减毒活疫苗问世

研究背景

非洲猪瘟是高致死生猪疫病，2018 年传入我国造成巨大经济损失，目前全球缺少成熟商业化疫苗。ASFV 毒力基因复杂，仅敲除单个毒力基因的弱毒株仍存在残留毒力、排毒传播、保护力不足等缺陷，难以满足实际防疫需求，亟需开发多基因联合缺失的安全高效疫苗。

前期研究证实 MGF505-7R 是病毒关键免疫逃逸基因，可抑制宿主干扰素通路；H240R 为衣壳蛋白，参与病毒组装并抑制炎症免疫。单独敲除任一基因仅能部分致弱病毒，团队据此提出双基因同步敲除策略，叠加致弱效果，兼顾病毒复制能力与生物安全性。

研究结果

通过同源重组技术，以 HLJ/18 强毒株为亲本，依次用 p72 启动子驱动的 EGFP、mCherry 荧光报告盒替换 H240R、MGF505-7R 基因，经 10 轮空斑纯化获得无亲本病毒污染的双基因缺失重组毒株；荧光显微镜下感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）可同时观测红绿双色荧光，内外侧引物 PCR 测序证实两个目标基因完全敲除、报告基因正确插入。体外生长动力学结果显示，双缺失毒株复制滴度较亲本强毒株下降约 1.0 log，复制水平显著高于单敲除 ΔH240R 毒株，说明敲除 MGF505-7R 可部分恢复病毒复制能力，解决单一 H240R 缺失毒株增殖不足、疫苗量产难度大的问题。

图1 重组毒株 ASFV-ΔH240R-Δ7R 构建、鉴定及体外复制特征

动物安全与攻毒保护试验分为同居对照、低剂量（10³ HAD₅₀）免疫、高剂量（10⁵ HAD₅₀）免疫三组：同居空白仔猪攻毒后出现典型 ASF 脏器损伤，心脏、肝脏弥漫出血，脾脏肿大发黑易碎，肺、肾脏、全身淋巴结大面积出血坏死；低剂量免疫仔猪仅肺部、淋巴结存在轻微局部损伤；10⁵ HAD₅₀高剂量免疫仔猪全部无肉眼可见病理损伤，仅淋巴结轻微红肿。结合组织切片病理结果，高剂量免疫组无淋巴细胞耗竭、无弥漫性出血与炎性细胞浸润，证明双缺失毒株可诱导机体产生完全保护性免疫，阻断强毒在体内复制与脏器损伤。

图2 攻毒后各组仔猪脏器剖检病理对比

研究首先完成重组病毒 ASFV-ΔH240R-Δ7R 的构建与体外特性验证，通过荧光标记、PCR、全基因组测序多重手段确认毒株纯合无野毒污染；连续 30 代 PAMs 体外传代后，毒株荧光表达稳定、仅出现少量不影响核心基因的零星突变，证明遗传稳定性优异，不存在返强风险。动物安全性试验中，分别以 10³、10⁵ HAD₅₀剂量肌肉免疫 SPF 仔猪，28 天全程无发热、沉郁、皮肤发绀等任何 ASF 临床症状；免疫仔猪血液、口鼻肛拭子病毒载量极低，同居仔猪未检出病毒、无 p30 特异性抗体，证实毒株几乎无排毒、无水平传播能力。免疫后 7 天即可检测到 p30 特异性抗体，28 天抗体持续阳性。28 天免疫期结束后以致死剂量 HLJ/18 强毒攻毒，两组免疫仔猪存活率均为 100%；低剂量组仅少数仔猪出现一过性短暂发热，伴随轻微脏器病理损伤；高剂量组仔猪全程无任何临床症状，体内病毒复制水平极低，各组织器官病毒载量显著低于对照组，剖检与组织病理学均无显著病变。综合体外、体内试验证实，H240R 与 MGF505-7R 联合敲除可实现病毒完全致弱，高剂量单次免疫即可提供无损伤、无发病的完全同源保护。

总结与展望

本研究构建 H240R/MGF505-7R 双基因缺失 ASFV 弱毒株，解决单基因缺失毒株残留毒力、复制不足的短板；毒株传代稳定、无水平传播，高剂量免疫可实现同源强毒完全保护，具备疫苗产业化潜力。后续将验证疫苗对异源毒株的广谱保护效果，优化免疫程序，评估体内传代返强风险，同时拓展多基因敲除改造方案，助力非洲猪瘟商用疫苗研发。

来源：Li J, Song J, Zhou S, Li S, Liu J, Li T, Zhang Z, Zhang X, He X, Chen W, Zheng J, Zhao D, Bu Z, Huang L, Weng C. Development of a new effective African swine fever virus vaccine candidate by deletion of the H240R and MGF505-7R genes results in protective immunity against the Eurasia strain. J Virol. 2023 Oct 31;97(10):e0070423. doi: 10.1128/jvi.00704-23. Epub 2023 Sep 28. PMID: 37768081; PMCID: PMC10617561.