水产品中副溶血性弧菌的动态接头靶环化 RCA结合LAMP抗干扰检测

  副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)是一种常见的水生食品，包括贝类和虾中的致病菌。它在3～5%NaCl中生长迅速，能耐受高盐(高达10%)和低温(低于15℃)。V副溶血性是引起食物中毒的病原体，如腹泻、恶心、呕吐、腹部绞痛，甚至死亡。虽然高温会杀死它们，但由于越来越多的人喜欢直接食用，生食海产品很容易沾染这种病原体，并会引起严重的食物中毒病例。因此，需要高效的检测方法来避免食物中毒。

  介绍

  开发了一种抗干扰的RCA模式，称为目标环化滚动圆放大。在这种方法中，一个双链DNA靶点被一个双链适配器环化后直接作为扩增的模板。由于引物直接针对副溶血性弧菌基因，特异性显著提高。但由于目标环化产率较低，其灵敏度不理想。提出了一种新的快速抗干扰检测方法，具有更高的灵敏度。在本方法中，通过使用一个短的动态适配器，大大避免了意外的连接阻断目标环化，从而令人满意地提高了环化灵敏度。在接下来的步骤中，结合线性RCA和简化LAMP对环化目标进行高特异性放大，这两种方法同时进行。利用线性RCA从大量背景DNA中预扩增靶点，以具有长重复序列的单链产物作为LAMP模板，只使用一对针对副溶血五氏体基因的引物。此外，羟基萘酚蓝(HNB)易于实现视觉检测。目的环化RCA和简化LAMP(TRCA-LAMP)在检测副溶血弧菌时具有足够的灵敏度和特异性，具有较大的背景基因组，在食品和其他复杂样品的病原体检测中具有广泛的应用前景。

  原理

  图1. 目标环化RCA和简化LAMP(tRCA灯)的组合图示。(A) 动态适配器将目标循环化为圆形模板。(B)环化靶标通过线性RCA扩增为具有重复序列的长ssDNA。(C)简化的LAMP仅由一对引物进行，通过实时荧光即可检测扩增产物

  该方法的原理由靶环化和线性滚动圆扩增(tRCA)和简化环介导的等温扩增(LAMP)组成，示意性地描述在方案 1.在靶环化之前，限制性内切酶用于将从水生样品中提取的DNA消化为具有随机序列的粘性末端的片段。然后，具有与靶片段互补的粘性末端的动态适配器将靶标环化成dsDNA环。这里的动态意味着适配器处于杂交和解离状态之间的平衡状态，因为 Tm其双相部分接近或低于连接温度。由于接头的 5′ 末端之一未磷酸化，因此在 dsDNA 环中形成切口，用于起始位点，用于后续 RCA 中的引物延伸. 线性RCA和简化的LAMP在系统中同时执行。在线性RCA预扩增过程中，DNA环作为模板，使痕量靶标转化为具有数百倍重复序列使用这些长重复的靶DNA序列作为LAMP的模板，数百个FIP引物可以同时结合到一个长分子上. 随着扩增的处理，从后一个 FIP 延伸的产物取代了前一个 FIP 的产物，并且形成了在 5' 末端具有环的 ssDNA。以同样的方式，BIP引物从FIP结合到产物，并通过两个环延伸到ssDNA，这是LAMP的核心元件。这样，只需两个引物(FIP和BIP)就能进行高效的LAMP，几十分钟内就能检测到扩增产物。

  实际样品检测

  图2.人工污染的牡蛎样品的目标检测。(A)实时荧光分析。(B)通过羟基萘酚蓝 (HNB) 目视检测副溶血弧菌。[HNB] = 120 μmol/L，扩增时间为 40 分钟。(C)未知样品的检测结果。

  RCA灯用于检测被副溶血性弧菌人工污染的牡蛎样品，范围为2.2×101–2.2 × 108CFU/g (图2).视觉检测可以使结果更加直观和方便，而无需使用荧光检测器。在这里，通过在扩增系统中添加羟基萘酚蓝染料(HNB)来实现视觉检测(图2B) 。在扩增之前，HNB由于与Mg结合而呈紫色2+.随着扩增的进行，镁2+与焦磷酸盐逐渐形成沉积物，使HNB变成蓝色，其原始颜色。样品为2.2×101–2.2 × 106目标的CFU/g从紫色变为蓝色(图2B)，表明HNB可以清楚地区分副溶血性弧菌的目标浓度差异。此外，通过该方法检测未知样品(图2C)，在荧光分析和肉眼检测中都可以与阴性对照明确区分。

  结论

  使用动态适配器并结合RCA和LAMP，开发了一种新的核酸扩增策略(靶向环化滚动环扩增与环介导的等温扩增，tRCA-lamp)，具有高效率、灵敏度和特异性。RCA和LAMP具有相同的反应条件，可实现一锅放大。此外，通过在系统中添加HNB来实现视觉检测。该方法检测副溶血性弧菌，检测限为 22 cfu/g。

  参考文献：Boying Zhang, Wenhua Sun,Lingling Ran,Chenru Wang,Jing Wang,Ran An. Anti-Interference Detection of Vibrio parahaemolyticus from Aquatic Food Based on Target-Cyclized RCA with Dynamic Adapter Followed by LAMP.Foods. 2022.