创新手段促进新机制发现：细菌生物膜中噬菌体抗性的产生

中文题目：必需的噬菌体成分诱导细菌群落产生抗性

期刊及年份：Science Advances，2024

https://doi.org/10.1126/sciadv.adp5057

通讯作者：刘锦涛，清华大学医学院副教授。主要运用多学科的理论和定量的研究方法，聚焦于对生物被膜的群体行为及其动态特性进行深入的研究，探索细菌群体中的新规律及其与人体健康的关系。

摘要：尽管我们对细菌层面的噬菌体抗性已有广泛了解，但对细菌群落的抗性仍不甚清楚。鉴于其普遍性，理解群落层面的抗性至关重要。我们对肺炎克雷伯菌生物膜中噬菌体感染的动态进行了定量研究。我们发现生物膜迅速发展出抗性并恢复了生长。抗性的产生并非由于突变，而是由噬菌体裂解的细菌释放的未组装噬菌体尾纤维引起的。尾纤维降解了对感染至关重要的细菌荚膜，并在生物膜中诱导了荚膜丢失的传播，调节尾纤维和荚膜水平可以改变抗性。尽管存在抗性，生物膜中仍能维持潜伏感染，允许噬菌体和细菌稳定共存。最后，我们展示了抗性暴露了生物膜中的脆弱性。我们的发现表明噬菌体裂解液在塑造噬菌体-生物膜相互作用中发挥重要作用，并为合理设计用噬菌体对抗细菌的策略开辟了更多维度。

主要内容

图1主要介绍微流控装置的原理和观测方法，新方法的应用让我们得以看到从未见过的新现象。

图1. 肺炎克雷伯菌生物膜中噬菌体感染的时空动态。(A) 本研究中使用的微流控系统的示意图（顶视图）。生长培养基从入口注入，流经生长室，然后从出口流出。在每个实验开始时，通过装载通道将少量细菌注入到播种区（以蓝色标记）；这些细菌后来在生长室内生长成一个大的密集社区。(B) 噬菌体感染不同阶段的生物膜代表性图像。相位对比和PI（细胞死亡指标）荧光（以红色显示）的复合图像。比例尺，100微米。(C) 生物膜的动态图像（时空剖面）。y轴表示在(B)中显示的虚线沿线的PI荧光的空间剖面。x轴表示空间剖面随时间的演变。白色轮廓表示生物膜边缘的位置。PI荧光以红色显示。虚线表示噬菌体处理的时间。(D) 生物膜边缘的轮廓图。线条说明了生物膜边缘在每小时间隔的位置。颜色表示相应时刻生物膜的生长速率。比例尺，100微米。结果代表了三个以上的生物学重复。a.u.，任意单位。

文章中关于图1的内容描述了在微流控系统中培养的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)生物膜在受到噬菌体Kp11感染时的动态变化。实验中，当生物膜达到约500微米大小时，研究者使用低滴度的Kp11噬菌体（104 pfu/ml）处理生物膜1小时，然后切换回正常培养基，并且在整个过程中保持恒定的流速。在处理结束时，观察到生物膜边缘的一些局部区域被噬菌体感染，这是通过荧光细胞死亡指示剂碘化丙啶（propidium iodide, PI）显示的。作为对照，未处理噬菌体的生物膜中仅观察到低水平的细胞死亡，而且是零星发生的。大约2小时后，感染扩散到生物膜的整个边缘，观察到大量的生物膜被裂解，并且生物膜的生长停止了。由于外部的噬菌体供应已被移除，生物膜内感染的扩散是由噬菌体的复制驱动的。大约10小时后，生物膜在噬菌体处理后恢复了生长，尽管生长速率明显慢于感染前（感染前70微米/小时，感染后10微米/小时）。当切换到含有高滴度（108 pfu/ml）的Kp11培养基时，发现生物膜的生长速率并未受到影响，表明生物膜获得了对Kp11的耐药性。当生物膜恢复生长后，整个边缘的生长都是均匀的，这表明生物膜发展出的耐药性是表型（phenotypic）的，因为由突变引起的基因型（genotypic）耐药应该是随机的，并且只会导致局部的恢复生长。总之，生物膜在噬菌体感染后均匀的再生长是由于生物膜形成的表型耐药性所致。

图2. 噬菌体尾部纤维蛋白使生物膜对噬菌体感染具有抵抗力。(A) 测量生物膜中耐药细菌百分比的工作流程（材料与方法）。S1，噬菌体处理前生物膜的面积；S2，收集细菌前生物膜的面积。(B) 生物膜中耐药细菌的百分比。虚线表示如果耐药性是由突变引起的，预期的耐药细菌百分比与生物膜大小增加百分比之间的关系。(C) 生物膜在噬菌体感染时的动态图像。y轴表示在快照中显示的虚线沿线的相位对比强度的空间剖面。x轴表示空间剖面随时间的演变。黑色箭头指示动态图像上方显示的代表性相位对比图像的时间。红色箭头指示噬菌体处理诱导的相位带。比例尺，100微米。(D) 生物膜的相位对比（灰色）和荧光（绿色，表示FITC标记噬菌体粒子的浓度）图像的复合图。虚线表示生物膜的边缘。比例尺，100微米。(E) FITC标记噬菌体在生物膜中的穿透深度。误差条，标准差；五个生物学重复。(F) 生物膜在用纯化的噬菌体尾部纤维蛋白gp46（在噬菌体卡通中以红色显示，10微克/毫升）处理时的动态图像。y轴表示图S5A中显示的虚线沿线的相位对比强度的空间剖面。(G) gp46预处理（20微克/毫升）和噬菌体感染期间生物膜的生长速率。均为三个生物学重复的代表性结果。

噬菌体尾纤维使生物膜对噬菌体感染具有抗性。文章中关于图2的内容描述了噬菌体尾部蛋白gp46如何使肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)生物膜对噬菌体感染产生耐药性。研究者们首先通过微流控系统中的生物膜实验，观察了噬菌体感染后生物膜恢复生长的情况，并测量了生物膜中耐药细菌的百分比。他们发现，经过噬菌体处理后，生物膜中只有一小部分细菌（不到3%）对Kp11噬菌体产生了耐药性。这表明，这些耐药细菌可能是自然发生的突变体。在噬菌体感染后，生物膜的相位对比图像中出现了一个明亮的带，并且这个带随着感染的进展向生物膜内部移动。他们通过实验发现，这个带并不是由于噬菌体向生物膜内部扩散造成的，因为标记有荧光素的噬菌体（FITC标记的Kp11）只能在生物膜边缘约60微米内检测到。研究者们推测这个明亮的带可能与未组装的噬菌体尾部蛋白有关。他们发现，纯化的噬菌体尾部蛋白gp46能够诱导生物膜中出现相同的带，经过gp46处理3小时后，生物膜对高滴度（107 pfu/ml）的噬菌体产生了耐药性。

图3. 噬菌体尾部纤维蛋白在生物膜中的作用。(A) 示意图显示了噬菌体感染包膜细菌的过程。步骤1：噬菌体尾部纤维与细菌包膜特异性结合；步骤2：尾部纤维降解包膜；步骤3：噬菌体与细菌外膜（OM）上的次级受体特异性结合。(B) 细菌的相位对比和荧光图像。野生型（WT；左）和包膜缺陷型细菌（中间）分别与mCherry-gp46孵育，野生型细菌（右）与mCherry孵育。孵育后10分钟成像。比例尺，1微米。(C) 分别与gp46和gp46mut孵育的细菌的复合图像。在指定时间后捕获。比例尺，1微米。(D至F) 动态图像显示用mCherrygp46mut（左）、mCherry-gp46（中间）、mCherry-gp46mut加噬菌体（右）处理的生物膜。y轴表示图S6（D、E和G）中显示的虚线沿线的mCherry荧光的空间剖面。x轴表示空间剖面随时间的演变。(G至I) 动态图像显示用gp46mut（左）、gp46（中间）和噬菌体（右）处理的生物膜。y轴表示图S7（C至E）中显示的虚线沿线的mTq2荧光（在ompk26启动子下表达）的空间剖面。白色标记表示生物膜的边缘。所有结果代表了三个生物学重复。gp46的浓度为10微克/毫升，除了(B)和(C)（100微克/毫升）以及(F)（1微克/毫升）。

文章中关于图3的内容描述了噬菌体尾部蛋白gp46在生物膜中的作用，特别是它如何与细菌表面的荚膜相互作用以及如何促进其在生物膜中的渗透。研究者们发现，gp46蛋白能够特异性地结合到细菌表面的荚膜上，并且随着时间的推移，这种结合会导致荚膜的降解。他们通过使用带有mCherry标签的gp46蛋白（mCherry-gp46）来可视化这一过程，观察到mCherry-gp46在野生型细菌表面的积累，而在荚膜缺陷菌株ΔwcaJ中则没有积累。这表明gp46蛋白能够特异性地与细菌表面的荚膜结合。研究者们观察到mCherry-gp46的荧光逐渐减弱并在25分钟内消失，这表明gp46蛋白降解了荚膜。通过使用Alcian blue染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，他们证实了gp46确实具有解聚酶活性。为探究gp46蛋白在生物膜中的渗透，研究者们使用mCherry-gp46处理生物膜。结果显示，具有降解酶活性的mCherry-gp46能够在生物膜中形成一个明亮的带，并且随着时间的推移，这个带逐渐向生物膜内部移动。这表明gp46蛋白的解聚酶活性促进了其在生物膜中的渗透。研究者们还发现，噬菌体感染导致的gp46蛋白的释放能够引起生物膜中荚膜的降解。他们通过首先使用mCherry-gp46mut标记生物膜中的荚膜，然后使用噬菌体处理生物膜，观察到噬菌体导致mCherry-gp46mut逐渐向生物膜内部渗透。研究者们还探讨了细菌对gp46蛋白的反应。他们通过RNA测序分析发现，gp46处理能够显著上调ompK26基因的表达，该基因编码外膜蛋白孔蛋白。他们构建了一个荧光报告菌株来监测ompK26启动子的活性，并发现gp46处理导致ompK26在生物膜中表达上调，这表明gp46蛋白能够渗透到生物膜中并诱导细菌的响应。综上所述，图3展示了噬菌体尾部蛋白gp46如何通过结合和降解细菌表面的荚膜，促进其在生物膜中的渗透，并诱导细菌的响应。

此处提出了本研究建立的理论模型，并打开了防控耐药菌的新的思路

图4. 生物膜对噬菌体的抗性机制。(A) 示意图显示了噬菌体感染细菌生物膜的过程和抗性的形成。左：生物膜边缘遇到噬菌体。中：生物膜边缘被噬菌体感染并裂解，释放出更多噬菌体和未组装的尾部纤维。右：未组装的尾部纤维扩散到噬菌体前面，降解细菌包膜，导致低包膜区域的形成，该区域扩展到生物膜中。(B) gp46处理对生物膜恢复时间的影响。插图显示了实验工作流程。误差条，标准差；三个生物学重复。(C) 抑制gp46表达（见图S8）对生物膜恢复时间的影响。[anhydrotetracycline] = 1 ng/ml。对照组十个生物学重复，抑制组四个。(D) 噬菌体感染前生物膜的生长速率及再生期间的生长速率。十个生物学重复。(E) 报告噬菌体Kp11::sfgfp的示意图，用于观察单个细菌中的感染。(F) 噬菌体感染后生物膜边缘的影片条。sfgfp荧光（绿色）表明细菌中活跃的噬菌体复制。比例尺，100微米。(G) gp46处理对生物膜再生期间生长速率的影响。与(B)中相同的实验工作流程。生长速率以噬菌体感染前速率为基准进行标准化。误差条，标准差；三个生物学重复。(H和I) 调节包膜水平（见图S10）对生物膜恢复时间和再生速率的影响。插图显示了实验工作流程。三个生物学重复。(J) 过度表达包膜对噬菌体感染结果的影响。从生物膜培养开始就以100 μM IPTG过度表达包膜。比例尺，100微米。三个生物学重复的代表性结果。所有统计数据[(B)、(C)、(D)、(G)、(H)和(I)]均表示为平均值 ± 标准差；统计显著性通过双侧学生t检验确定：P = 0.00145和****P = 2.595 × 10−07。

文章中关于图4的内容描述了生物膜对噬菌体感染产生耐药性的机制，以及通过调节噬菌体尾部蛋白gp46或细菌荚膜水平来改变生物膜对噬菌体的敏感性。研究者们提出了一个关于生物膜如何发展出耐药性的假设机制：由于细菌的密集堆积，噬菌体在生物膜中的扩散受到限制，因此噬菌体感染从生物膜边缘开始，并逐渐向生物膜内部发展。在噬菌体复制过程中，未组装的尾部蛋白被释放到生物膜中，这些蛋白附着在细菌表面，降解荚膜，然后从细菌上脱离，再次附着在其他细菌上。通过这个过程，尾部蛋白促进了自己在生物膜中的渗透，导致生物膜中荚膜缺失的扩散。基于这个机制，研究者们预测调节自由gp46水平将影响生物膜对噬菌体的耐药性。实验结果显示，增加gp46浓度可以加速生物膜生长的恢复。相反，通过使用dCas9抑制gp46基因的转录，减少生物膜中自由gp46的水平，可以显著增加生物膜恢复生长的时间。此外，文章还提到了生物膜在从噬菌体感染中恢复后生长速率显著减慢的现象。研究者们通过构建一个报告噬菌体，发现即使在生物膜恢复生长后，生物膜边缘的某些细菌仍在持续被感染。研究者们还探讨了通过调节细菌荚膜水平来影响生物膜对噬菌体的敏感性。他们通过改变诱导剂IPTG的浓度来控制细菌荚膜的表达水平，并发现增加荚膜水平可以减慢生物膜在噬菌体感染后生长的恢复速率。噬菌体尾部蛋白对细菌荚膜的降解可能对抗生素的渗透产生重要影响，并提出了结合噬菌体和抗生素的策略。此外，他们还展示了噬菌体与纤维素酶结合使用，通过降解细菌荚膜来增强纤维素酶渗透效率，从而更有效地分散和消灭生物膜。综上所述，图4强调了生物膜耐药性的形成机制，并展示了通过调节噬菌体尾部蛋白或细菌荚膜水平来调节生物膜对噬菌体感染敏感性的可能性，以及这些发现对开发新的治疗策略的潜在应用。

图5. 利用噬菌体对抗生物膜的启示。(A) 分别用卡那霉素（蓝色）、噬菌体（黑色）和噬菌体-卡那霉素组合（红色）处理的生物膜生长动态。卡那霉素浓度为6.25 μg/ml（0.5×最小抑菌浓度，MIC）。噬菌体浓度为107 PFU/ml。数据表示为三个生物学重复的平均值 ± 标准差。(B) 在抗生素和噬菌体-抗生素组合处理24小时后生物膜大小的百分比增加，两个生物学重复的平均值。抗生素浓度为相应MIC的0.5倍：卡那霉素（Kan），6.25 μg/ml；庆大霉素（Gen），3.125 μg/ml；妥布霉素（Tob），3.125 μg/ml；环丙沙星（CIP），0.025 μg/ml；新霉素（Neo），3.125 μg/ml；多粘菌素E（PE），25 μg/ml；多粘菌素B（PB），12.5 μg/ml。(C) 单独使用多粘菌素B或与噬菌体组合处理的生物膜的快照。相位对比和PI荧光（红色）的复合图。时间表示处理的持续时间。对于组合处理，噬菌体处理在抗生素前3小时开始。多粘菌素B，156.25 μg/ml（6.25× MIC）。噬菌体，107 PFU/ml。比例尺，100微米。(D和E) 图C中显示的生物膜的生长动态。(F) 用gp46（10 μg/ml）和多粘菌素B处理的生物膜的生长动态。(G) 动态图像显示gp46处理前后mCherry蛋白在生物膜中的穿透情况。白色标记表示生物膜的边缘。红色表示mCherry荧光。(H) 用不同浓度的纤维素酶处理的生物膜的生长动态。(I) 分别用纤维素酶、噬菌体和噬菌体-纤维素酶组合处理的生物膜的生长动态。纤维素酶，8 U/ml；噬菌体，107 PFU/ml。(J) 图I中用噬菌体-纤维素酶组合处理的生物膜的相位对比图像。比例尺，100微米。所有结果代表了两个生物学重复的代表性结果。

文章中关于图5的内容讨论了如何利用噬菌体以及噬菌体尾部蛋白gp46对细菌生物膜的降解作用，来开发针对生物膜的抗菌策略。文章指出，噬菌体与某些抗生素的联合使用可以增强对生物膜的抑制效果。特别是，噬菌体Kp11与卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素的联合使用，可以在低抗生素浓度下快速抑制生物膜的生长。文章发现，gp46蛋白能够降解细菌的荚膜层，从而可能影响抗生素的渗透效率。例如，当gp46与多粘菌素B联合使用时，会降低多粘菌素B对生物膜的破坏效果。这是因为gp46降解了细菌的荚膜层，使得细菌对多粘菌素B的敏感性降低。研究者们探索了噬菌体与纤维素酶的联合使用，作为一种分散和消灭生物膜的策略。文章中提到，虽然单独使用纤维素酶需要很高的浓度才能有效，但是当与噬菌体联合使用时，可以显著降低所需的纤维素酶浓度，从而更有效地分散生物膜。文章建议，在设计噬菌体治疗策略时，需要考虑噬菌体尾部蛋白对细菌荚膜的降解作用，以及这种作用如何影响噬菌体与其他治疗剂（如抗生素或酶）的联合使用效果。文章还提到了治疗顺序的重要性。例如，在用噬菌体预处理生物膜后，再使用抗生素，可以使得噬菌体先降解细菌的荚膜层，从而增强抗生素的渗透和效果。最后，文章讨论了噬菌体鸡尾酒疗法的潜力，即结合使用针对不同细菌受体的噬菌体，以提高对生物膜的治疗效果。综上所述，图5及其相关讨论强调了在开发噬菌体治疗策略时，需要考虑噬菌体与细菌生物膜之间的复杂相互作用，以及如何通过联合使用其他治疗剂来提高治疗效果。

讨论

研究揭示了一种新的噬菌体抗性机制，这种抗性是由噬菌体感染细菌的必要步骤引起的。在这一过程中，噬菌体需要先与细菌表面的荚膜体结合，再降解它以便感染细菌。这种抗性在生物膜中特别明显，因为生物膜中的细菌排列紧密，使得噬菌体释放的未组装尾纤维能够提前降解细菌表面的荚膜体，从而保护细菌不受噬菌体的侵害。即便生物膜产生了抗性，生物膜边缘的细菌因为不断生成新的荚膜体，仍然可以被噬菌体感染。研究还发现，噬菌体释放的尾纤维可以影响抗生素的效果，因为它们降解了细菌的荚膜体，从而改变了细菌对抗生素的敏感性。作者提出，噬菌体治疗时不仅要考虑噬菌体本身，还要考虑它们裂解细菌后释放的物质，这可能对治疗策略产生重要影响。最后，作者建议在设计噬菌体疗法时，可以考虑使用不同类型的噬菌体混合物，因为它们可能更有效地消灭生物膜中的细菌。