近年来，抗生素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生领域的重大威胁。据世界卫生组织统计，2019年全球因耐药菌感染直接导致的死亡人数超过127万，而到2050年，这一数字可能攀升至每年1000万。传统抗生素的失效迫使科学家寻找替代疗法，其中噬菌体治疗因其特异性强、可自我复制的特性重新进入视野。然而，噬菌体疗法面临宿主范围窄、细菌易产生抗性等挑战。随着CRISPR-Cas基因编辑技术的突破，科学家开始将这一“基因剪刀”与噬菌体结合，开发出更精准、高效的“工程化噬菌体”，为个性化抗菌治疗带来革命性希望。

CRISPR-Cas：改写噬菌体基因组的“分子手术刀”

图1 利用CRISPR - Cas系统构建工程化噬菌体的基本策略之一

CRISPR-Cas系统源于细菌的天然免疫机制，能够精准识别并切割特定DNA序列。2020年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因开发CRISPR-Cas9技术获得诺贝尔化学奖，标志着基因编辑进入高精度时代。在噬菌体工程中，科学家通过以下步骤改造噬菌体：

• 设计向导RNA（gRNA）：gRNA包含与目标DNA互补的序列，引导Cas蛋白定位。
• Cas蛋白切割：Cas蛋白在gRNA指引下切割噬菌体基因组的特定位置，实现基因敲除、插入或修饰。
• 功能优化：例如，通过编辑尾部纤维蛋白基因，改变噬菌体识别宿主细菌的能力，从而扩大其宿主范围。
• 技术优势：与传统基因编辑相比，CRISPR-Cas具有高效、灵活和低成本的特点，尤其适用于噬菌体基因组的定向改造。

噬菌体工程的三大创新方向

1. 突破宿主范围限制

天然噬菌体的宿主特异性极高，仅能感染特定菌株。通过CRISPR-Cas技术，科学家可修改噬菌体尾部纤维蛋白的基因，使其识别不同细菌的表面受体。例如，Song等研究者通过替换噬菌体PHB20的尾部纤维基因（ORF40），成功使其感染原本无法侵染的大肠杆菌菌株。类似地，多价噬菌体（Polyvalent Phage）的研发可将单一噬菌体改造为“广谱杀菌武器”，显著提升治疗效率。

2. 精准打击耐药基因

CRISPR-Cas不仅能直接裂解细菌，还可靶向清除耐药基因。例如：

• 消除耐药质粒：Dong团队利用CRISPR-Cas9删除了大肠杆菌携带的mcr-1基因（介导多黏菌素耐药性），成功恢复细菌对抗生素的敏感性。
• 区分致病菌与共生菌：通过设计特异性gRNA，工程化噬菌体可精准杀灭携带毒力基因的病原体，而不影响肠道正常菌群，避免传统抗生素的“无差别攻击”。

3. 增强环境适应性

工程化噬菌体在复杂环境（如生物膜）中仍能高效杀菌。例如，SNIPR001（一种CRISPR武装的噬菌体组合）在小鼠模型中显著降低了肠道内耐药大肠杆菌的负荷，并有效抑制生物膜形成。此外，这类噬菌体还可用于环境治理，清除污染水源或土壤中的耐药菌。

应用场景：从医疗到环境治理

图2 CRISPR - Cas辅助噬菌体工程的应用     

1. 临床治疗：针对耐药性尿路感染、败血症等，工程化噬菌体已进入临床试验。例如，Locus Biosciences公司利用CRISPR-Cas3增强噬菌体裂解能力，成功治疗耐药大肠杆菌引起的尿路感染。

2. 快速诊断：噬菌体可搭载报告基因（如荧光标记），接触目标细菌后触发信号，实现病原体的快速检测。

3. 食品安全：在食品加工中喷洒工程化噬菌体，可特异性杀灭李斯特菌等食源性致病菌，替代化学防腐剂。

4. 生态修复：清除污水厂或农业环境中的耐药菌，阻断耐药基因传播链。

挑战与局限性

尽管前景广阔，CRISPR-Cas辅助噬菌体工程仍面临多重挑战：

1. 技术瓶颈：

PAM序列限制：Cas蛋白需依赖特定的PAM序列（如Cas9需NGG）才能切割DNA，可能限制靶点选择。

脱靶效应：Cas蛋白可能误切非目标基因，导致噬菌体功能异常。

2. 细菌抗性演化：细菌可能通过突变受体或表达抗CRISPR蛋白（Acr）逃逸噬菌体攻击。

3. 伦理与监管：工程化噬菌体的环境释放可能影响生态平衡，需建立国际标准规范其应用。

未来展望：从实验室到临床的跨越

1. 多样化CRISPR系统开发：除常用的Cas9外，Cas3、Cas12a、Cas13a等酶的特性可被进一步挖掘。例如，Cas13a靶向RNA的特性为抗RNA病毒提供了新思路。

2. 联合疗法：将噬菌体与抗生素、免疫调节剂联用，可减少耐药性产生并增强疗效。

3. 人工智能助力设计：通过机器学习预测噬菌体-宿主相互作用，优化gRNA设计，提升编辑效率。

4. 全球化合作：建立噬菌体库与耐药基因数据库，推动资源共享和技术标准化。

结语：重塑感染治疗的未来

CRISPR-Cas辅助噬菌体工程标志着医学从“广谱杀菌”向“精准狙击”的范式转变。尽管仍需克服技术、伦理与商业化难题，但其潜力已在小鼠模型和早期临床试验中得到验证。随着跨学科合作的深化，这一技术有望在未来十年内成为抗击耐药菌的核心武器，为全球公共卫生安全提供坚实保障。正如研究者所言：“我们正站在一场医疗革命的门槛上，而钥匙就藏在噬菌体的基因组中。”

参考文献：

Chaudhary N, Sharma K, Kaur H, Prajapati S, Mohan B, Taneja N. CRISPR-Cas-assisted phage engineering for personalized antibacterial treatments. Indian J Med Microbiol. 2025 Jan-Feb; 53:100771. DOI: 10.1016/j.ijmmb.2024.100771.