噬菌体联合靶向抑制人类IBD相关肠道微生物共生菌治疗肠道炎症

  炎症性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎(UC)，克罗恩病(CD)和不确定结肠炎，是自身炎症性疾病，其特征是不受控制的先天和适应性免疫反应导致持续的组织损伤。

  肠道菌群通过多种机制导致遗传易感IBD患者的异常免疫反应。事实上，病原体的定殖，如粪肠球菌、产肠毒素脆弱拟杆菌，或耐多药肺炎克雷伯菌(Kp)，被认为是导致遗传易感宿主IBD恶化的原因。

  然而，迄今为止，使用广谱抗生素治疗人类IBD仍存在争议，并与不良反应有关，如肠道菌群失调、耐药菌株的出现等。在不影响周围微生物生态系统的情况下，持续、有针对性地消除IBD相关病原体仍然是一项艰巨的挑战。

  噬菌体是普遍存在的自我复制病毒，通过与同源细菌受体的相互作用介导，以高宿主特异性感染细菌。作为针对多重耐药病原体的治疗手段，最近对系统利用噬菌体治疗的关注，显示出有希望的结果。

  肺炎克雷伯菌(Kp)菌株与不同地域的IBD严重程度相关。分离的Kp菌株在动物IBD模型定殖后诱导肠道炎症;而以Kp为靶点的五噬菌体组合，发现能够抑制IBD模型中的肠道炎症。对健康人摄入的噬菌体进行评估，发现是安全、可行的，并在肠道下部积累。口服五种噬菌体的组合成功靶向肺炎克雷伯菌，治疗了人类炎症性肠病的症状。

  总的来说，我们证明了口服联合噬菌体治疗在避免耐药性方面的可行性，同时有效抑制非传染性疾病的致病病原体。

  我们通过分析来自法国、以色列、美国和德国的四个地理位置不同的IBD队列的肠道微生物群组成，开始了我们的探索。

  对来自四个队列的粪便样本的鸟枪宏基因组分析显示，CD和UC患者的微生物丰富度较低(图1A)。在全球范围内，UC和CD患者之间以及UC或CD与健康对照组之间的粪便微生物群组成存在显著差异(图1B)。

  此外，在每个个体队列中，IBD患者与健康对照组之间的显著整体差异被Bray-Curtis差异量化(图1C)。在所有地理上不同的队列中，与对照组相比，CD和UC患者中有5种细菌显著富集(图1D)。在这五种细菌中，与缓解期间的样本相比，CD患者在爆发期间采样的Kp和大肠杆菌也显著富集，而UC患者在爆发期间只有Kp没有显著耗尽(图1D)。由于这些原因，我们选择将重点放在Kp上。

  在法国队列中，与对照组相比，CD和UC患者中的Kp都过高(图1E)。而对以色列、美国、德国队列的研究同样证实了上述发现，CD和UC患者中Kp丰度更高，德国队列为UC患者的Kp扩大(图1F、G、H)。

  在三个队列(法国、以色列、美国)中，IBD患者根据临床症状和C反应蛋白(CRP)水平进一步分为疾病突然发作或缓解(图1I)。与健康对照组相比，无论处于突发或缓解状态，CD患者的微生物丰富度都较低。

  在CD和UC患者中，与各自缓解对照组或健康受试者相比，急性发作患者的粪便微生物群落结构在全球范围内存在差异(图1J)。与缓解期CD患者相比，CD突发患者的全球社区结构与丰富的Kp丰度相关(图1K)。

  图1：地理位置不同的IBD患者具有丰富的肠道肺炎克雷伯菌

  (A)粪便菌群α多样性按疾病、Shannon指数。(B)主坐标分析(PCoA)根据疾病，Bray-Curtis 差异。(C) Bray-Curtis在地理位置上与健康对照组的不同。(D)热图：与缓解期相比，IBD亚型和爆发期富集的前10个物种。(E - H)在(E)法国，(F)以色列，(G)美国和(H)德国队列中的差异丰度。根据疾病以颜色显示;蓝色：Kp;黑色：差异丰富种。(I) CD和UC患者发作期或缓解期C反应蛋白水平。(J) PCoA，基于Bray-Curtis差异，根据炎症状态的参与者之间。(I) PCoA与(J)相似，参与者根据Kp丰度着色。

  由于许多与疾病相关的病原体被认为具有显著的抗生素耐药性，从而限制了疾病的根除。接下来，我们确定了与IBD相关粪便微生物群相关的耐药基因组剖面，以及它是否对应于Kp。为此，我们共同量化了所有队列的患者和对照组中抗生素耐药基因(ARGs)的丰度。

  我们注意到，与健康对照组相比，CD和UC患者的耐药基因组α多样性(图2A)和差异抗药性组成(图2B)有所扩大。此外，Kp丰度与整体耐药基因组剖面显著相关(图2C)。

  同样，我们探索了所有个体中与粪便微生物群相关的移动遗传元件(MGEs)的情形。我们观察到，与对照组相比，IBD亚型具有更高的α多样性(图2D)和不同的移动基因组分布(图2E)，也与Kp相关(图2F)。遗传元素和细菌家族丰度的相关分析发现，肠杆菌科(Kp家族)与疾病中过度代表的差异ARGs和MGEs之间存在显著相关性，其中一些与Kp显著相关(图2G) 。

  在功能上，IBD患者的粪便微生物群聚类与健康对照组不同(图2H)，这一特征也与Kp丰度的差异有关(图2I)。同样，在Kp菌株中，与对照相比，每个IBD亚型中与氨基酸、核苷酸、甘露糖和果糖代谢相关的几个京都基因和基因组百科全书(KEGG) Orthology (KO)术语更丰富(图2J)。

  总的来说，在所有四个地理上独立的IBD队列中观察到粪便中Kp的显著富集，并与疾病突发状态有关。在其他肠杆菌科物种中，与IBD相关的ARGs和MGEs库中的扩展是由Kp丰度的扩展驱动的，这可能会导致这些IBD相关病原体表现出对抗生素治疗的耐药性。

  图2：IBD患者肺炎克雷伯菌的功能分析

  (A)粪便微生物区系抗药组α多样性按疾病、Shannon指数。(B-C)主坐标分析(PCoA)，Bray-Curtis 差异，根据(B)疾病或(C) Kp丰度着色。(D-F)与(A-C)相似，粪便微生物群移动基因组。(D) Alpha多样性，Shannon指数。(F) Kp丰度。(G) IBD患者中细菌家族与差异丰度耐药基因和移动遗传元件的丰度相关性分析。红圈为遗传因子，与Kp丰度显著相关。(H-I) PCoA的生物循环功能通路，基于(H)疾病或(I) Kp丰度。(J) UC和CD患者中Kp相关KEGG Orthology (KO)术语的热图与Ctrl相比显著增加。

  不同的Kp菌株，如Kp-2H7，先前被认为可以在小鼠肠道中引起促炎反应。为了阐明在我们的队列中与人类IBD相关的可能的Kp菌株，我们最初分析了沿着Kp细菌基因组的read分布。

  我们改变了Kp reads的数量，并发现在所有地理队列中，IBD的Kp仍显著扩大(图3A)。接下来，我们量化了健康个体和IBD患者中特定Kp菌株的相对丰度，确定了共存的代表性菌株的数量和身份，以及它们在每个宏基因组样本中的相对丰度，以最小的Kp reads数。

  使用这种方法，我们鉴定出Kp KSB1_4E菌株在所有IBD亚型中明显更丰富，与缓解状态相比，在爆发期间富集(图3B)。有趣的是，该菌株与之前发现的Kp-2H7菌株聚集在同一个分支中，因此被称为“IBD相关”或Kp2分支(图3C)。

  在地理和环境不同的人群中对复杂疾病中微生物群的广泛的物种和菌株水平的阐明，可能能够识别致病病原体物种和菌株的特定支(“驱动”菌株)，同时将它们与许多其他菌株区分开来，这些菌株的丰度变化是与疾病相关过程相关的(“乘客”菌株)。

  这种优化的解决方案还可能澄清一些与物种水平疾病关联相关的模糊发现，同时将治疗工作集中在特定临床背景下的真正病原体菌株上。

  图3：IBD患者具有丰富的肠道Kp2分支

  (A)四个地理位置Ctrl、CD和UC患者粪便中Kp丰度归一化。(B)热图表示CD组和UC组相对于Ctrl组之间的log10差异倍数，或者在前12个Kp菌株爆发和缓解状态之间的变化。(C) NCBI数据库中356株Kp菌株的单核苷酸变异(SNV)系统发育树

  为了测试Kp2分支在IBD发展中的参与程度，我们将多个临床非Kp2和Kp2分离株口服接种到无菌(GF)野生型(WT)小鼠中(图4A)，并测试了它们的定殖和引发促炎反应的能力(图4B)。

  在Kp-2H7菌株之间，结肠粘膜固有层白介素(IL)-17+ CD4+ T细胞丰度没有差异，而与非Kp2菌株KTCT 2242相比，所有测试的临床Kp分离株的干扰素(IFN)-γ和IL-17共表达均显著增加(图4C)。

  为了进一步评估临床Kp2菌株诱导的体内促炎反应，将GF IL-10 /小鼠定殖于汇集的11个Kp菌株联盟中，为期2或4周，然后检测IL-10和IFN-γ分泌(图4D)。

  与非Kp2临床菌株激活的脾细胞裂解液相比，所有临床Kp2分离株诱导了较低的IL-10表达和分泌(图4E)。总的来说，在Kp2菌株刺激的脾细胞中观察到促炎反应，即IFN-γ/ IL-10比值较高(分别在2或4周后，图4F)。

  事实上，在定殖2周后，观察到粪便脂脂素(一种肠道炎症的非侵入性标记物)增加。基于这些结果，我们选择了三株最有可能诱导促炎反应的Kp2菌株，并与所选临床Kp2菌株单定殖GF IL-10 /小鼠2周(图4G)。结果发现，每个测试的Kp2菌株都诱导了粪便脂质素(图4H)和IFN-γ(图4I)。

  对单接种小鼠切除的大肠进行组织病理学评估，发现结肠组织严重发炎。与GF IL-10 /小鼠相比，未注意到对腺体结构的破坏性影响(图4J和4K)。有趣的是，在单接种单个Kp2菌株的IL-10 /小鼠中，固有层IFN-γ水平与肠道炎症和损伤的组织病理学评分密切相关(图4L)。

  图4：临床Kp2分离株的肠道定殖可增强小鼠炎症和组织损伤

  (A-C) GF WT小鼠的单定殖。(A)实验设计。(B-C) (B)第20天评估结肠中IFN-γ和(C) IFN-g IL-17产生的 CD4+ T细胞的百分比。(D-F)GF IL-10+/EGFP小鼠定殖，共11株Kp分离株。 (D)实验设计。(E)测定表达IL-10+/EGFP脾白细胞百分比。(F) IFN-γ/IL-10比值的定量。(G-L) GF IL-10/ 小鼠定殖实验。 (G)实验设计。(H)感染2周后，检测粪便中对单个Kp2菌株的脂脂素水平。(I)结肠IFN-γ产生 CD4+ T细胞百分比。(J)盲法组织病理学评分。(K) Kp2菌株定殖后的代表性结肠组织病理学切片。(L) Kp定殖后IFN-γ的产生与组织病理学评分之间的线性回归。

  鉴于上述关于人类IBD相关耐抗生素Kp菌株对肠道炎症的因果贡献的证据，我们接下来寻求开发一种噬菌体联合疗法，特异性抑制致病Kp2分支。

  为此，针对Kp-2H7和另外16株临床Kp2菌株的噬菌体被分离出来，并在迭代过程中进行测试，直到在所有测试的分支菌株和突变体中识别出有效的组合(图5A)。

  通过将不同的噬菌体组合引入Kp-2H7和两个临床Kp2分离株123-1和141-1的培养物中进行测试(图5B-5D)。总的来说，由噬菌体MCoc5c、8M-7、1.2-3s、Kp2 -5-1和PKP-55组成的噬菌体组合5(E)在减轻人类ibd相关Kp2菌株的细菌负担方面具有最一致的组成和功能能力，因此被选择用于进一步的小鼠和人体实验。

  噬菌体基因组没有携带有毒或毒性序列(例如，缺乏ARG、毒素、MGEs和整合酶)。重要的是，宏基因组微生物群分析显示，计算预测的受体丰度，被选定的五个噬菌体用于停靠Kp2菌株，在IBD患者中显着高于整个队列的健康对照组(图5 G)。

  图5：kp2靶向噬菌体的选择与检测

  (A-F)针对Kp2分支开发噬菌体组合的迭代过程。(A)实验方案。从环境样本中分离出Kp2靶向噬菌体，对其进行测序和分类，并在体外评估其宿主范围。(i)对最初分离的噬菌体的不同噬菌体组合进行体外抗Kp2菌株试验;(ii)在此阶段发育的细菌突变体作为从环境样本中分离新型噬菌体的靶点;(iii)在不同Kp2菌株定殖的小鼠体内检测最有效的最终组合;(iv)确定了减少Kp2负载和防止突变外观的最佳噬菌体组合(v)。(B - D)体外测试(B)三噬菌体，(C)四噬菌体，(D)五噬菌体组合。用OD600在20小时内评估细菌生长情况。(E)体内筛选阶段的实验设计。SPF小鼠用泰乐肽治疗(4天)，用Kp-2H7定殖，然后用氨苄西林治疗(4天)。噬菌体以不同的组合(即3(D)， 4(F)， 4(G)， 5(E)， 5(F))灌胃，在定殖后第6、9和12天，浓度为5 × 109 PFU/mL。(F) Kp-2H7和123-1菌株在噬菌体处理期间的CFU。(G)表，通过基因组测序或基于噬菌体分析预测的5(E)噬菌体组合可能靶向的细菌受体。热图，对接受体的平均kp相关丰度。

  接下来，我们评估了噬菌体组合5(E)在临床前IBD模型中降低Kp2负荷和影响结肠炎症的疗效。我们首先优化口服给药方案，在抗生素治疗后，以不同噬菌体浓度和灌胃频率给Kp-2H7定殖的SPF小鼠使用噬菌体组合，同时测试它们对Kp2负荷和噬菌体浓度的影响(图6A, 6B)。

  通过每天给予107 PFU/mL噬菌体组合5(E)或3周给予109 PFU/mL噬菌体组合5(E)，可以获得最佳的Kp2根除。与每日剂量相比，在3周剂量为109 PFU/mL的情况下，观察到噬菌体复制最高(图6A)，同时粘膜粘附细菌中Kp的负载减少(图6C)，而且显著降低了结肠Kp诱导的IFN-γ T细胞水平(图6D)。

  因此,选择这种给药方案进行进一步试验。我们接下来确定噬菌体组合5(E)是否可以改善Kp2菌株在口服右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的急性IBD样自身炎症。

  在噬菌体治疗开始4天后，在饮用水中注入1.5% DSS，引起结肠自身炎症。事实上，噬菌体处理小鼠的大肠粪便(图6E)和黏膜(图6F)中的Kp-2H7细菌负担显著降低。

  结肠炎症特征，包括固有层IFN-γ+ CD4+ T细胞的百分比(图6G);大肠细胞因子水平，包括IL-15、IL-17、IL-9(图6H-6J);和结肠炎严重程度通过结肠镜量化(图6K)在噬菌体治疗小鼠中显著减弱。

  噬菌体治疗的小鼠明显改善了肠道炎症和组织损伤(图6 K-6M)，具有持续的Kp负荷降低(图6N)，与载体处理的对照组相比，噬菌体处理小鼠的存活率显著提高(图6O)。

  为了评估噬菌体联合治疗在自身炎症环境下的长期病原体抑制能力，用109 CFU/mL的Kp-2H7单定殖GF Rag1 /小鼠，然后转移5 × 106个CD4+ CD45RBhigh T细胞，导致轻度亚临床疾病。事实上，在这种情况下，长期的噬菌体联合治疗诱导了粪便(图6P)和粘膜(图6Q) Kp细菌负荷的持续慢性抑制。在这种情况下，亚临床炎症在噬菌体治疗下表现出不显著的改善趋势。噬菌体联合治疗在预防或治疗由不同微生物组抗原负荷驱动的全面慢性肠道自身炎症方面的影响值得进一步研究。

  图6：噬菌体组合有效改善小鼠结肠炎

  (A-C) SPF小鼠在Kp-2H7定植前给予泰乐肽治疗(4天)，随后给予氨苄西林(4天)和洗脱(2天)。小鼠接受3周剂量的5(E)组合(噬菌体符号)或载体(噬菌体缓冲)。(A) Log10 PFU计数标准化为克粪便后，3周剂量5(E)组合SPF小鼠105和109 PFU/mL。插图:噬菌体治疗期间的AUCs。(B)比较了5(E)、105和109 PFU/mL两种浓度的Kp-2H7感染疗效。插图:噬菌体治疗期间的iAUCs。(C) Kp-2H7大量粘附于肠黏膜。(D)来自Kp-2H7单定植GF小鼠的固有层衍生的IFN -γ+ CD4+ T细胞。 (E-J)结肠炎，饮用水中DSS 1.5%(灰色区域)，GF定殖后20天，5 ×109 CFU/mL，噬菌体治疗开始于定殖后第16天。(E) Kp-2H7 Log10粪便CFU。(F)粘膜相关Kp-2H7 。(G)结肠IFN -γ+ CD4+ T细胞百分比。(H - J)测定结肠外植体培养24 H后上清液中(H) IL-15、(I) IL-17和(J) IL-9的水平。(K)补充DSS后8天评估结肠镜严重程度评分。(左和中)(左)结肠上皮组织病理学评分和(M)代表性组织学图像。(N和O) DSS结肠炎与术前相同，小鼠随访后恢复。(N)Log10粪便Kp-2H7 CFU。(O)生存曲线。(P和Q) CD4+ CD45RBhigh T细胞转移到先前感染Kp-2H7的GF Rag1 /小鼠诱导的肠道炎症。(P)粪便Kp-2H7计数。(Q)结肠粘膜Kp-2H7。

  接下来，我们确定了噬菌体联合治疗在人类环境中的可行性。由于肠道生物物理特征在小鼠和人类之间有显著差异，我们首先评估了噬菌体组合5(E)的两个选定噬菌体通过人体肠道微生物生态系统模拟器(SHIME)时的稳定性(图7A)。

  在低pH条件下，1.2-3s噬菌体活性下降，而MCoc5c噬菌体在胃期结束时几乎丧失活性。相比之下，在较高的胃pH条件下，噬菌体的稳定性更高(图7B)。两种噬菌体的活性没有受到模拟人类近端小肠的因素和条件的进一步影响，同样地，其活性在代表更多远端肠生态位的其他腔室中保持稳定，如空肠、回肠、近端和远端结肠(图7B-7D)。

  最后，我们在人类志愿者中测试了这两种噬菌体，旨在评估口服供给药噬菌体通过健康个体的人类胃肠道(GIT)后的生存能力。18名健康成年志愿者(11名男性和7名女性)被随机分配口服两噬菌体组合或安慰剂，以液体制剂的形式口服，每天两次，持续3天(图7E)。

  噬菌体组合包括MCoc5c和1.2-3s，每剂量总PFU为2.8×1010。鉴于上述模拟结果，所有受试者还接受口服埃索美拉唑，以提高胃pH值，从而优化噬菌体存活。

  独特的是，从试验的第1天到第6天收集所有参与者的排泄粪便，通过PFU分析定量测量活噬菌体的总量(图7E)。两噬菌体制剂耐受性良好，治疗组和安慰剂组之间的治疗紧急不良事件(TEAEs)发生率相似症状轻微。噬菌体组无治疗相关TEAE;1名受试者出现与治疗相关的TEAE(即腹胀)。未发现严重不良事件或导致停止研究药物或参与研究。

  第1天，在收集的12个样本中，只有1个被检测到噬菌体(8.3%)，这可能反映了人类肠道运输时间缓慢。然而，在接下来的几天里，在所有采集样本的受试者中都检测到了噬菌体，除了在第3天，11个样本中有10个检测到了噬菌体。

  通过对14名受试者收集的所有粪便样本进行计算，MCoc5c和1.2-3s的总PFU中位数分别为1.46 × 1010和1.08 ×109(图7F)。有趣的是，在第4、5和6天，所有拥有可用样本的受试者都检测到噬菌体，尽管噬菌体在第3天就已经给药完毕(图7G)，这可能代表噬菌体持续存在。

  总的来说，该研究达到了其主要目标，即证明两种以Kp为靶向的口服噬菌体在健康成年人中是安全的，且耐受性良好。此外，即使在使用噬菌体数天后，GIT中仍可检测到高水平的MCoc5c和1.2-3s噬菌体，并且累积的总剂量预计将超过IBD患者中测量到的Kp菌株的目标细菌水平近1000倍。

  粪便微生物群鸟枪宏基因组测序显示，所有健康参与者中预期的极低基线Kp丰度，而仅在噬菌体处理的个体中检测到两种噬菌体的丰度增加，从而验证了PFU定量。在噬菌体治疗的参与者中未观察到脱靶生态失调(图7H和7I)。完全噬菌体组合诱导的Kp2抑制和可能的脱靶效应值得在携带IBD相关Kp2菌株的人类中进行未来的研究。

  口服噬菌体能够忍受胃肠道波动的生物物理条件，并在肠道和粪便中积累。这种口服给药途径可以避免噬菌体诱导的免疫原性。在IBD中，这种治疗可能潜在地补充诱导治疗，其中病原体抑制将有助于猝灭急性疾病加重或维持治疗，其中病原体的慢性抑制可能延迟或预防疾病发作。类似的噬菌体联合治疗可用于抑制导致其他一些由微生物组引起的传染性和非传染性人类疾病的病原体，其中包括幽门螺杆菌相关的消化性溃疡疾病等。这些令人振奋的前景值得进一步研究。

  图7：口服噬菌体持续存在并积聚在健康人类志愿者的肠道下部

  (A)人体胃肠模拟器方案(系统在特定时间点收集样本，并评估噬菌体数量(PFU定量)) 。(B - D) 1.2-3s(绿色)和MCoc5c(橙色)在不同时间点和pH在(B)上消化道，(C)近端和(D)远端结肠的Log10总PFU。(E) I期随机、单盲、安慰剂对照临床试验的图形表示。所有受试者在噬菌体给药前3天至治疗开始后3天接受埃索美拉唑(40 mg，每天1次)。5(E)组合的五种噬菌体中的两种(MCoc5c和1.2-3s)被包括在内，并在每剂量总噬菌体浓度为2.8 3 1010 PFU的情况下进行测试，从第1天到第3天每天两次。从第1天到第6天收集所有受试者的粪便(>20 g)，使粪便噬菌体总量量化。(F)噬菌体PFU中位数。虚线，3天内单个噬菌体的总量(总剂量为6次)。(G)口服后受试者每日粪便中噬菌体检测总水平的中位数。(H)基于Bray-Curtis差异的18名参与者纵向样本的PcoA。填充圆圈，接受噬菌体组合的参与者;开放圆圈，接受安慰剂。样品由参与者着色。(I)在噬菌体或安慰剂治疗的中期和末期计算出与基线的成对Bray-Curtis差异。

  期刊信息：

  影响因子/JCR分区： 66.850/Q1

  卷：185，期：16，页：2879-+

  DOI: 10.1016/j.cell.2022.07.003