通过逐层微囊化改善唾液乳杆菌Li01缓解结肠炎症的作用

  胃肠道运输过程中的低活力和粘液粘附差极大地限制了唾液乳杆菌-Li01在调节肠道微生物群和缓解炎症性肠病(IBD)方面的有效性。在这项研究中，设计了一种通过使用壳聚糖和海藻酸盐将单个Li01细胞逐层封装的递送系统。通过交联加强这些层，形成一个坚固而粘附力强的外壳(约10nm)。逐层包覆的Li01在模拟胃肠道条件下表现出更好的活力和粘膜粘附功能。在消化液中孵育2小时后，未包被的Li01细胞几乎没有检测到，而对于逐层包覆的Li01，总减少量约为3 log CFU/mL，活细胞数保持在6 log CFU/mL以上。此外，与裸露的Li01相比，LbL Li01的(细菌-黏液)粘附曲线中发现了破裂的长度值增加5倍和峰值的数量增加2倍。结肠炎小鼠口服LbL Li01有助于肠道屏障恢复和肠道微生物群的恢复。通过逐层包覆的方式改善Li01的功能性，可以增加益生菌在临床应用中用于治疗IBD的潜力，这应该在未来的研究中进行探索。

  研究结果

  1.负载Li01的逐层系统的合成与表征

  本研究以唾液乳杆菌Li01为益生菌菌株，用壳聚糖和海藻酸盐交替进行逐层包封。壳聚糖已被证明对粘蛋白具有高度粘附性，并伴有生物相容性。海藻酸盐具有高粘膜生物相容性，整体上表现出中等的粘膜粘附特性。然而，Li01细胞表现出负电荷(约-9.24 mV)。因此，封装过程首先涂覆壳聚糖层，然后涂覆海藻酸盐层以形成一个双层。图1a显示了LbL-Li01制备的示意图。海藻酸盐分子可以与钙和锌离子的组合在更大程度上交联(R2+)与单独的钙离子相比。除了与海藻酸盐的聚古洛糖醛酸单元结合并产生所谓的“蛋盒”结构外，R2+溶液已被证实可与海藻酸盐分子的不同位点结合。因此，在海藻酸盐-壳聚糖双层形成后，壳通过交联海藻酸盐上的羧基而得到加固。

  LbL Li01的形貌和理化性质如图1所示。当细胞仅用一个双层装饰时，发现它们的表面没有完全被生物聚合物覆盖。表面外壳涂有两到三个双层后变得更厚，更致密。观察到用罗丹明缀合的海藻酸盐制备的LbL LiO1的荧光强度随着双层数的增加而增加。表明细胞可以被多个海藻酸盐-壳聚糖双层包被，每层双层的厚度为~4-5纳米。增加输送系统的粘度可能会影响摄入食物的胃肠道运输，特别是通过延长保留时间，显然，减少上消化道的运输时间应该可以提高益生菌的活力。在较低的剪切速率下，涂覆双层(01C1A，1C2A和2C3A)后，LbL Li3的粘度降低(图1f)。当Li01涂覆两个双层(2C2A)时，其粘度最低。

  图 1 逐层封装Li01微球的表征。

  2.Li01的活力和粘膜粘附

  口服后，益生菌在到达肠道或结肠中的功能活动部位之前通过上消化道。通过平板计数法和LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒量化游离Li01和LbL Li01对模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)的存活能力，以确定其活菌与死菌的比例。与胃酸相比，Li01细胞对胆汁盐更敏感(图2a-d)。胆汁主要对细胞膜和干扰大分子稳定性(包括DNA和RNA)从而发挥抗菌作用。通过共聚焦显微镜，发现大多数裸露的Li01细胞在SGF和SIF中死亡，而大多数LbL Li01细胞是存活的(图2c，d)。这可以归因于海藻酸盐羧酸在不同pH条件下的质子化和去质子化。由于CA双层的良好溶胀特性，可以促进渗透刺激性化合物并为细胞提供良好的保护。

  图2 模拟胃肠道运输过程中益生菌的活力。

  本研究使用Caco-2细胞模型评估了LbL包封后益生菌粘附能力。此外，还测量了作为上皮屏障完整性指标的跨上皮电阻。裸露的Li01或LbL Li 01 h后，观察到Caco-2细胞单层的TEER增加。与裸露的Li01细胞相比，用LbL Li01处理的单层的TEER水平增加显着更高。如图所示测量粘附在Caco-05细胞单层上的细菌量，荧光强度加倍，表明与裸露的Li01细胞相比，粘附在单层上的LbL Li01细胞数量更多。图3c显示了附着在单层上的细菌的微观结构，这证实了Li3细胞附着在Caco-2单层的微绒毛上。

  图3 裸露Li01和LbL Li01在Caco-2细胞模型上的粘附能力。

  为了确定益生菌GI在体内转运和定植的动力学，使用了无菌大鼠模型。通过裸露Li01或LbL Li01的管饲法喂养大鼠。这些结果还表明，与裸露Li01细胞相比，LbL Li01在肠道定植方面似乎更有效。

  研究表明，海藻酸盐和壳聚糖具有粘膜粘附特性，可以粘附在粘液上以增加停留时间，从而促进益生菌在肠道中的定植。粘液是大分子成分的密集网络，其主要成分是高度糖基化的粘蛋白。细菌细胞表面成分在促进与粘液和上皮细胞的粘附相互作用中起着关键作用。为了充分了解LbL包封对Li01与粘蛋白之间相互作用的影响，采用原子力显微镜(AFM)测量了粘蛋白与Li01之间的粘附(图4a)。因此这些生物分子在粘蛋白功能化的AFM缩回期间被拉伸。乳酸杆菌属表面可能含有菌毛或EPS，参与细菌聚集并特异性结合粘蛋白。在益生菌涂覆双层后，不参与离子凝胶网络形成的海藻酸盐的甘露糖醛含量通过形成氢键和其他范德华相互作用在粘膜粘附中起关键作用。

  图4 粘蛋白与裸露Li01和LbL Li01之间相互作用的强度和动力学。

  3.益生菌对缓解结肠炎症的作用

  Li01和LbL Li01对结肠炎症的治疗效果采用DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型测定(图5a-f)。与喂食其他治疗方案的小鼠相比，喂食LbL Li01的小鼠的结肠长度显着更长(图5b)，表明LbL Li01具有优越的改善效果。所有用LbL Li01处理的小鼠在实验结束时都活着，而用裸露的Li01处理的小鼠存活率仅为70%。此外，用LbL Li5处理的小鼠显示出更快的体重恢复趋势(图5d)。

  图5 Li01治疗右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠的影响。

  在处理后小鼠的循环血浆中还测定了促炎细胞因子(包括IL-6，IL-1β和TNF-α)抗炎细胞因子(IL-10)的水平(图5e)。TNF-α、IL-1β和IL-6是针对感染和组织损伤产生的，IL-6的失调、持续合成对结肠炎症和自身免疫有病理作用，而IL-10的表达和分泌可以防止DSS诱导的结肠炎。研究结果表明，与其他组相比，LbL Li01治疗后与低水平的促炎细胞因子相关，这表明LbL Li01在促进结肠上皮改善方面具有优越性。

  组织学结果与上述结果一致，与喂食其他治疗的小鼠相比，用LbL Li01治疗的小鼠损伤评分显着降低(P < 0.05)，表明LbL Li01具有促进结肠上皮快速恢复的潜力(图5f)。空白组和游离Li01组也在一定程度上表现出改善结肠炎的效果。

  胃肠道炎症性疾病总是伴随着肠道微生物群的生态失调，口服Li01可通过调节肠道微生物群来缓解结肠炎。为了研究游离Li01和LbL Li01对DSS诱导结肠炎小鼠肠道微生物群组成的影响，采用了基于16 S rRNA基因的宏基因组学。如图5g，i所示，与喂食生理盐水的小鼠相比，喂食LbL Li01的小鼠中Muribaculaceae，Allobaculum和Bifidobacterium的相对丰度要高得多。患有进行性结肠炎的小鼠通常在微生物群中表现出肠道共生的消耗。Allobaculum已被证实产生短链脂肪酸，并与体重呈正相关，有助于维持结肠功能和上皮结构。与游离Li01相比，LbL Li01喂养组中Muribaculaceae的丰度更高，而Allobaculum和Bifidobacterium的丰度没有差异。微生物组的主坐标分析(PCoA)(图5h)显示对照组与其他实验组的聚类相反，结果显示用LbL Li01治疗可能有助于肠道微生物群的更快恢复。

  总之，这项工作证明了LbL递送系统在提高唾液乳杆菌Li01细胞在胃肠道的存活率和功效方面的潜力。包封后，它们在模拟胃肠道环境中的活力得到显着提高。LbL输送系统的另一个独特之处在于其增强的粘膜粘附特性。Li01细胞的这些附加功能有助于增强其改善小鼠DSS诱导的结肠炎的功效。

  原文参考：Anselmo AC, McHugh KJ, Webster J, Langer R, Jaklenec A. Layer-by-Layer Encapsulation of Probiotics for Delivery to the Microbiome. Adv Mater. 2016 Nov;28(43):9486-9490. doi: 10.1002/adma.201603270. Epub 2016 Sep 12. PMID: 27616140; PMCID: PMC5287492.