坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种主要影响新生儿，尤其是早产儿的严重胃肠道疾病。存活的患儿可能会遗留消化系统和神经系统的后遗症，如短肠综合征、肠狭窄及神经系统发育异常等。

目前的研究表明，NEC 与肠道微生物群失调密切相关。肠道菌群的紊乱激活了一系列细胞因子，破坏了肠粘膜屏障，并在肠壁组织中引起过度的炎症反应，从而导致肠上皮细胞的局部或弥漫性坏死。然而，肠道微生物群在 NEC 中的致病作用尚未完全阐明。

近期一篇发表在《Gut Microbes》上的文章“Bacteroides fragilis alleviates necrotizing enterocolitis through restoring bile acid metabolism balance using bile salt hydrolase and inhibiting FXR-NLRP3 signaling pathway”揭示了NEC胆汁酸代谢紊乱和TCDCA对NEC进展的毒性作用，证实脆弱拟杆菌通过调节胆盐水解酶和抑制FXR-NLRP3信号通路恢复胆汁酸代谢平衡来改善坏死性小肠结肠炎。

NEC 婴儿胆汁酸代谢紊乱

研究者收集了10例健康婴儿和9例NEC婴儿的血清和粪便。发现NEC组中血清总胆汁酸（TBA）水平显著高于正常水平。

为了进一步探讨 NEC 患者和健康婴儿粪便中胆汁酸水平的差异，作者使用 LC-MS 进行了靶向代谢组学来评估胆汁酸组成，结果显示NEC组的胆汁酸组成与健康组有显著差异，NEC组中TCDCA显著增加，而牛磺去氧胆酸（TDCA）减少，NEC组总胆汁酸（TBA）明显降低，次级/初级胆汁酸比值没有显著差异，游离/共轭胆汁酸比例明显低于正常组。NEC 婴儿血清 TBA 水平升高，粪便 TBA 水平降低。这些结果表明 NEC 婴儿胆汁酸代谢紊乱。

图1.NEC患儿胆汁酸代谢障碍

TCDCA促进NEC发病

接着作者试图探究升高最显著的 TCDCA 是否促进或抑制 NEC 发病机制。

作者建立了 NEC 的动物模型，并给予 TCDCA 或 TDCA进行 。结果显示，NEC 组大鼠小肠变短且出现严重肠道损伤，包括肠上皮破坏、部分回肠凝固性坏死和致密的炎症细胞浸润（图 2b-d)。经口服 TCDCA 治疗后，NEC+TCDCA 组大鼠肠道组织较短，损伤较 NEC 组严重。此外，NEC 组促炎细胞因子 IL-6 的 mRNA 水平显著高于对照组，而 NEC + TCDCA 组的 IL-6 水平高于 NEC 组（图 2e)。然而，口服 TDCA 后，NEC+TDCA 组大鼠肠道组织较长，炎症 HE 评分较低，损伤较小（图 2b-d)。TDCA+NEC 组 IL-6 mRNA 水平显著低于 NEC 组 （图 2e)。

接着，作者使用肠道类器官评估 TCDCA 和 TDCA 在 NEC 中的作用。结果显示，在 NEC 组中，类器官的结构完整性被破坏，在类器官的核心观察到死细胞。NEC + TCDCA 组的损伤和细胞死亡比 NEC 组更严重 （图 2 f-g）。TDCA+NEC 组的损伤和细胞死亡少于 NEC 组 （图 2 f-g).这些发现表明 TCDCA 加重了 NEC 的发病进程，而TDCA 减轻了该症状。

图 2. TCDCA 促进了 NEC 的发病进程

FXR等胆汁酸代谢相关基因在NEC中异常

作者对相关数据集进行GSEA分析，观察到两条通路在NEC组中富集（图 3a)，由于FXR参与了这两种途径，作者使用IHC检测了FXR表达。IHC 染色显示，NEC 组回肠和肝脏的 FXR 蛋白水平显著高于对照组。TCDCA 治疗后，FXR 表达高于对照组，而经 TDCA 处理后，FXR 表达低于NEC组（图 3b-c)。

接着作者使用 western blot 分析进一步测量了回肠和肝脏中 FXR 调节基因的蛋白水平。发现NEC 组和 TCDCA+NEC 组的回肠和肝脏中 FXR 蛋白水平被激活，而 TDCA 处理后 FXR 降低 。位于 FXR 下游的回肠中 FGF19 蛋白水平的变化与FXR一致(图 3d)。肝脏中 OATP 和 NTCP 蛋白水平的变化与 FXR 中的变化一致 ，而肝脏中 CYP7A1 和 BSEP 蛋白水平的变化表现出与 FXR 相反的趋势 （图 3e)。

接着作者建立了NEC的动物模型，并用FXR抑制剂E/Z-GS（图 3f)。发现E/Z-GS 治疗后肠道长度的减少、炎症的 HE 评分和回肠损伤被逆转(图 3g-i)。E/Z-GS处理逆转了回肠中IL-6的mRNA水平（图 3j)。

总的来说，上述数据表明 FXR 和胆汁酸代谢相关基因在 NEC 中是异常的，并且 FXR与 NEC 的致病机制密切相关。

图 3.  NEC 的胆汁酸代谢紊乱

FXR 与 NLRP3 相互作用并调节蛋白质降解

研究者利用生物信息学技术分析了有NEC和无NEC婴儿肠道组织的两个表达序列观察到“REACTOME_THE_NLRP3_ INFLAMMASOME”和其他7条通路在NEC组中富集，免疫共沉淀结果显示IEC-6细胞中FXR和NLRP3之间存在相互作用（Fig.4）。

图 4.FXR 与 NLRP3 相互作用并调节蛋白质降解

脆弱拟杆菌含有胆盐水解酶(BSH)

先前的研究表明，TCDCA 与 NEC 密切相关并在体内激活 FXR，这表明降低该化合物的浓度可能代表一种新的治疗方法。多项研究表明，BSH 在细菌中将 TCDCA 转化为 CDCA，因此研究者决定鉴定具有高BSH活性的细菌。首先，作者使用来自培养的人类肠道细菌 （CHGB） 的 1520 个参考基因组对BSH进行了生物信息学分析。将细菌分为 29 个属，包括拟杆菌属、瘤胃球菌属、双歧杆菌属、真杆菌属和梭状芽胞杆菌属 （图 5a)。近 98.5% 的拟杆菌属菌株携带BSH基因。此外，20%（154 个菌株）的拟杆菌属菌株仅编码一个 BSH 基因 （图 5b），而 47% （180 株）的拟杆菌属和 13% （50 株） 瘤胃球菌属菌株具有两个或三个旁系同源 BSH 基因。这表明拟杆菌门菌株具有较高的 BSH 活性率 （图 5c)。按属区分 BSH 可能不代表一种合理的方法，因为 BSH 旁系同源物隐藏在细菌基因组中。因此，作者通过系统发育分析将CHGB中的 1579 个 BSH 基因分为 7 个系统型（图 5d)。总的来说，作者预测拟杆菌门菌株将表现出高 BSH 活性率。同时作者了进行了 BSH 活性实验，以确定最有效的益生菌。在系统中检测了 214 株细菌菌株的 BSH 基因。qPCR 显示，脆弱芽孢杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、干肠球菌和粪肠球菌具有BSH编码基因。4株益生菌菌株也表现出 BSH 酶活性 （图 5e)。计算得出的脆弱拟杆菌总BSH活性显著高于其他细菌（图 5f)。敲除脆弱拟杆菌中的一个 bsh 基因后，BSH 酶活性显著降低 （图 5e)。发现B. fragilis含有BSH基因，并能调控BSH活性(图 5f)。

图 5.细菌菌株中的BSH和脆弱芽孢杆菌具有有效的 BSH 酶活性

脆弱拟杆菌在体内减轻 NEC

作者在 NEC 模型中评估了B.fragilis和BSH基因的治疗效果(图 6a)。在用脆弱拟杆菌干预后NEC模型的短肠改善(图 6b-c)。HE染色还显示NEC+B.fragilis组NEC大鼠炎症和肠道损伤的 HE 评分减轻（图 6b-d)。在 B. fragilis 处理后，NEC 大鼠中 IL-6 的转录水平也降低，存在bsh基因（图 6e），从而表明 B. fragilis 通过BSH基因有效缓解新生大鼠的 NEC 肠炎。

图 6. B. fragilis 在 NEC 模型中的治疗效果

接下来，作者研究了脆弱拟杆菌是否调节微生物群落的组成以发挥对 NEC 的保护作用。肠道微生物群的主坐标分析 （PCoA） 显示脆弱拟杆菌 + NEC 组和 NEC 组之间存在明显的分离。值得注意的是，脆弱拟杆菌 + NEC 组与对照组表现出更相似，表明口服脆弱拟杆菌治疗具有显著影响。有趣的是，NEC 组、NEC+TCDCA 组和 NEC+E/Z-GS 组聚集在一起，这意味着 TCDCA 和 E/Z-GS 对肠道微生物群的影响最小(图 6f).基于α多样性估计，NEC、NEC+TCDCA和NEC+E/Z-GS 组的 Shannon 指数降低被脆弱拟杆菌逆转 (图 6g)。在门水平上，在脆弱拟杆菌处理后，厚壁菌门丰度的降低和变形菌门丰度的增加被逆转 （图 6h），在属水平上，脆弱拟杆菌处理后乳酸菌丰度的降低和埃希氏菌-志贺氏菌丰度的增加也发生了逆转，从而表明脆弱拟杆菌恢复了 NEC 肠道菌群失调(图 6i)。Lefse 分析显示，链球菌、葡萄球菌和大肠埃希菌等病原菌在NEC、NEC+TCDCA 和NEC+E/Z-GS组中的丰度增加。相比之下，在脆弱拟杆菌+NEC 组中，拟杆菌属和乳球菌属的丰度表现出显著差异，表明脆弱拟杆菌可以在肠道定植并纠正肠道菌群失调(图 6j)。

脆弱拟杆菌对胆汁酸代谢的影响

作者还探讨了 B. fragilis 是否通过调节胆汁酸代谢来缓解 NEC。胆汁酸的 PCoA 显示脆弱拟杆菌 + NEC 组和 NEC 组（图 7a)。与对照组和脆弱拟杆菌 + NEC 组相比，NEC 组 TCDCA 浓度显著升高(图 7b-c)。各组之间仲/初生胆汁酸的比值未表现出统计学上的显著变化 (图 7d)。NEC 组未结合/结合胆汁酸的比例显著低于对照组和脆弱芽孢杆菌 + NEC 组 （图 7e)。

图 7. B. fragilis 对胆汁酸代谢的影响

接着，作者探讨了 B. fragilis 及其 BSH 基因是否抑制 FXR-NLRP3 信号通路。通过 IHC 染色以检测回肠和肝脏组织中 FXR 的表达。结果表明，脆弱拟杆菌抑制了 NEC 中 FXR 表达的增加(图 8a-b)。作者进行了 western blotting 和 ELISA 检测 FXR-NLRP3 信号转导中基因的蛋白水平 (图 8c-d)。结果显示，NEC 组回肠和肝脏中 FXR 蛋白水平被激活，脆弱拟杆菌处理后 FXR 降低 (图 8d)。位于 FXR 下游的回肠中 FGF19、NLRP3 和IL-1β的变化与FXR一致 (图 8c-d).肝脏中 OATP 和 NTCP 蛋白水平的变化与 FXR 一致 （图 8e)。肝脏中 CYP7A1 和 BSEP 蛋白水平的变化表现出与 FXR 相反的趋势(图 8e)。然而，这些变化在脆弱拟杆菌中 BSH 基因敲除后被逆转。

最后，作者评估了脆弱拟杆菌和 BSH 的体外治疗效果。NEC 组类器官受损的结构完整性和细胞死亡通过脆弱拟杆菌处理被逆转 (图 8f-g)。敲除脆弱拟杆菌 BSH基因后，类器官的损伤和细胞死亡增加 (图8f-g)。这些发现表明，脆弱拟杆菌通过恢复肠道菌群失调、调节胆汁酸代谢和抑制 FXR-NLRP3 信号通路来缓解 NEC。

图 8. B. fragilis 抑制 FXR-NLRP3 信号通路并减轻 NEC

全文总结

研究通过临床样本、胆汁酸靶向代谢组学、病理染色和生物信息学分析等方法揭示了NEC的分子机制。同时发现在NEC患者中，血液中的总胆汁酸增加，而粪便中的胆汁酸减少，FXR和其他胆汁酸代谢相关基因的水平异常，导致胆汁酸代谢紊乱。牛磺胆酸加速了NEC的发病进程，而牛磺脱氧胆酸则缓解了NEC进程。脆弱拟杆菌具有胆盐水解酶基因和酶活性，能够通过恢复肠道微生物群失调和胆汁酸代谢异常来缓解肠道损伤。此外，脆弱拟杆菌还能通过抑制FXR-NLRP3信号通路来减轻NEC。

参考文献 ：Chen Z, Chen H, Huang W, et al. Bacteroides fragilis alleviates necrotizing enterocolitis through restoring bile acid metabolism balance using bile salt hydrolase and inhibiting FXR-NLRP3 signaling pathway. Gut Microbes. 2024;16(1):2379566. doi:10.1080/19490976.2024.2379566