代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD），以前被称为非酒精性脂肪肝（NAFLD），是由甘油三酯过度积累开始，逐渐发展为代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH，以前称为NASH）、肝纤维化和肝硬化的连续性肝脏病理过程。肥胖和胰岛素抵抗是导致MASLD的主要原因。由于肥胖患者的脂肪酸（FAs）来源中只有新生脂肪生成（DNL）显著增加，因此抑制DNL被认为是一种有吸引力的治疗方法。要确定MASLD/MASH中特定的DNL靶点，有必要全面解读肝脏中FA合成的分子组成和过程，例如肝脏DNL碳骨架的主要营养素来源。

碳水化合物历来被认为是DNL的主要驱动因素，但令人费解的是，葡萄糖或果糖在肝脏脂肪酸中的结合率却很低。在大鼠原代肝细胞和灌注肝脏中进行的体外和体内示踪剂研究发现，与乳酸、丙酮酸、乙酸和丙氨酸相比，葡萄糖是一种较差的DNL底物。最近的示踪剂输注研究大大推进了我们对循环代谢物在组织代谢中的贡献的理解。2024年10月25日，广州实验室傅肃能、中科中山药物创新研究院廖一烈、新加坡科技研究局韩卫平团队合作，在Cell子刊《Cell Metabolism》上发表了题为“Amino acid is a major carbon source for hepatic lipogenesis”的研究论文。作者采用一种更直接的方法，标记膳食中的葡萄糖来量化全身新合成的脂肪酸，结果发现与其他组织相比，葡萄糖碳对肝脏DNL的贡献最小。因此，常规膳食中肝脏脂肪生成所需的碳骨架在50%以上的宏量营养素来源仍有待阐明。通过一系列通量分析、遗传干预和膳食操作，作者在此研究了宏量营养素底物对肝脏FA合成和肥胖症肝脂肪变性发展的定量贡献。

图解摘要

蛋白质摄入量与MASLD/MASH的发病率呈正相关

为了研究宏量营养素在MASLD/MASH中的作用，作者首先对美国国家健康与营养调查（NHANES）数据集（4,693名信息完整的参与者；图1A）进行了流行病学分析。与人们普遍认为的相反，碳水化合物和总脂肪的摄入量均未显示出与MASLD发病率增加有显著关联，而碳水化合物摄入量低与MASH进展风险高出约2倍有关。相反，膳食蛋白质含量与MASLD发病风险的增加呈正相关（中/高蛋白摄入组分别增加了1.45倍）。此外，高蛋白摄入会使罹患MASH的风险增加一倍，这与中/高脂肪摄入所观察到的情况类似。这些关联仅出现在肥胖参与者中（图1B），尤其是在60岁及以上的人群中。使用较早的NHANES III（1988-1994年）数据（11012人）也发现了类似的结果。这些结果揭示了膳食蛋白质在肝脏脂质积累中的潜在重要作用，而这一作用以前未被充分认识。

图1 不同宏量营养素摄入水平的美国人群罹患MASLD/MASH的风险

肝脏TCA循环的主要底物是氨基酸，而不是葡萄糖

肝脏是体内氨基酸分解代谢的主要场所。基于公共人类组学数据库的转录组分析表明，肝脏中氨基酸代谢基因的富集程度远远超过糖酵解基因（图2A）。为了确定氨基酸代谢在肝脏脂肪生成中的贡献，作者从瘦的野生型小鼠体内分离出原代肝细胞，并检测了三羧酸（TCA）循环的底物偏好，该循环是为合成代谢途径提供能量和碳前体的中心代谢枢纽。细胞外通量分析表明，氨基酸氧化占线粒体呼吸的33%，其次是12.4%的脂肪酸和4%的丙酮酸（作为葡萄糖的替代物）（图2B和2C）。只有在加入线粒体呼吸解偶联试剂后，丙酮酸才显著进入TCA循环（容量为36.4%）。因此，在正常情况下，丙酮酸氧化在肝细胞中并不受欢迎。

为了全面评估肝脏营养代谢的转归和通量，作者以13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺（体内含量最高的氨基酸）为代表示踪剂，在小鼠原代肝细胞中进行了平行同位素示踪（图2D）。令人震惊的是，用¹³C葡萄糖培养原代肝细胞可完全标记糖酵解代谢产物，但不能标记TCA中间产物（≤10%），这证实了细胞外通量分析（图2C）中确定的阻止丙酮酸进入肝脏TCA的代谢屏障的存在。作为进一步的证实，原代肝细胞的葡萄糖驱动耗氧率（OCR）几乎检测不到（<5%），而作为己糖对照的果糖则诱导了30%的OCR。相比之下，¹³C-谷氨酰胺容易标记TCA中间产物，标记率为50%，比葡萄糖高10倍（图2E和2F）。

图2 氨基酸是肝脏TCA循环的主要底物

氨基酸是肝脏DNL的主要碳供应源

柠檬酸盐可能会退出TCA循环，为脂肪生成提供燃料。氨基酸而非葡萄糖是氧化磷酸化的主要底物，这一发现表明肝细胞中的DNL不可能由葡萄糖提供燃料。为了验证这一假设，作者对从喂养的野生型小鼠体内分离出来的原代肝细胞中葡萄糖和谷氨酰胺合成甘油三酯脂肪酸的通量进行了类似的并排比较分析。追踪时间延长至6小时，以确保在不显著改变培养肝细胞与进食小鼠肝脏中关键酶表达的情况下完成标记。与假设一致，在肝细胞中，谷氨酰胺而非葡萄糖衍生的¹³C很容易与棕榈酸结合。谷氨酰胺和其他氨基酸的掺入效率分别是葡萄糖的14倍和8倍。总体而言，谷氨酰胺¹³C碳源的FA同位素富集度是葡萄糖的8至40倍（图3A-3C）。

除了葡萄糖，作者还比较了氨基酸与其他公认的DNL底物（如果糖、乳酸盐和醋酸盐）的致脂潜力。氨基酸（包括谷氨酰胺、丙氨酸和氨基酸混合物）掺入脂肪酸的水平与果糖、乳酸和醋酸相当，都远远超过葡萄糖（图3D）。按其在培养基中的浓度归一化后，氨基酸在体内外系统中对DNL的贡献最大（图3E）。当FA产物（即棕榈酸酯）的水平与循环中这些底物的生理浓度进行归一化后，氨基酸、醋酸盐和乳酸盐成为体内肝脏脂肪生成的主要碳源。此外，谷氨酰胺的标记效率略高于乳酸盐。估计新合成的棕榈酸酯占棕榈酸酯总库的17%（S%，图3F）。根据培养基中的底物浓度，氨基酸、醋酸盐和乳酸盐是原代肝细胞合成棕榈酸酯的主要成分（DNL、D%，图3F）（分别约为25%、7%和7%）。

最后，作者通过喂食含有均匀标记的葡萄糖或氨基酸（图4A）的食物模拟混合饮料（15%葡萄糖+5%氨基酸，3:1，w/w）的小鼠来定量氨基酸对体内肝DNL的贡献。选择在配方中混合葡萄糖和氨基酸，而不是淀粉和蛋白质，以减少消化引起的这两种大量营养素之间的吸收滞后。葡萄糖和氨基酸在不同程度上标记了葡萄糖代谢、核苷酸合成和TCA循环代谢物。大多数必需氨基酸（EAAs）容易被吸收并在血浆中显示出高标记效率，而一些非必需氨基酸（NEAAs），如谷氨酰胺/谷氨酸，可能在肠中大部分被清除。正如预期的那样，在氨基酸追踪的样品中，肝乙酰辅酶A（CoA）的标记效率高于葡萄糖，尽管氨基酸的量仅为混合饮料中葡萄糖的三分之一。定量地，氨基酸和葡萄糖都主要贡献DNL，分别提供新合成的棕榈酸酯中碳的30%和45%（图4B）。考虑到混合饮料中氨基酸的量是葡萄糖的1/3，当通过摩尔比标准化时，膳食氨基酸的脂肪生成潜力比葡萄糖大2倍或1.25倍（图4C）。由于大部分NEAAs（Gln/Glu）未被有效标记，氨基酸的贡献可能被低估。此外血浆和肝脏中的乳酸和丙氨酸基本上被标记的葡萄糖标记，这与之前的研究一致，即碳水化合物首先转化为有机酸并释放到循环中，然后用于能量生产。考虑到离体追踪结果，这些数据表明，肝脏中的膳食葡萄糖利用通过其在肝外组织中初始转化为有机酸，乙酸和NEAAs而得到促进，肝细胞几乎不在原位分解葡萄糖以产生能量或脂质合成。估计肝脏中30%的FA是由DNL产生的，氨基酸和葡萄糖共占DNL碳骨架的75%（图4D）。据估计，体内的DNL部分大约是体外的两倍，这可能是由于在生理条件下多种激素的激活作用增强和/或其他组织提供了额外的底物/脂肪酸。总之，这些结果表明，饮食中的氨基酸和葡萄糖是肝脏DNL的主要底物来源，尽管有机酸和代谢氨基酸通过肝内途径直接参与。

图3 氨基酸是肝脏新脂肪生成的主要碳供应者

图4 葡萄糖和氨基酸的体内代谢通量

膳食营养素与MASLD/MASH风险之间的相关性在肥胖亚群中更为显著（图1B）。此外，先前的研究揭示了氨基酸-mTORC-SREBP1轴在肥胖中被过度激活，这可能增强氨基酸对脂肪生成的贡献。为了检查在MASLD发育过程中氨基酸代谢通量是否改变，作者在从瘦和肥胖(ob/ob)小鼠分离的原代肝细胞中进行了同位素示踪（图S7A-S7C）。值得注意的是，肥胖将代谢通量从氧化性谷氨酰胺分解（正向反应，图S7D和S7E）转移到转氨（图S7F）和还原性羧化（反向反应，图S7G），其产物可以容易地喂养脂肪生成。基于模型的通量估计进一步揭示了肥胖小鼠肝细胞中糖酵解和TCA循环通量的总体升高以及不同的底物代谢重新连接。来自瘦小鼠的原代肝细胞中谷氨酰胺分解代谢至α-酮戊二酸的计算速率约为糖酵解的2至3倍，证实谷氨酰胺是TCA循环的较大贡献者，而不是葡萄糖。此外，通过比较不同营养条件下的TCA内流速度，作者确定了两个潜在的代谢节点，以形成对肝脏中氨基酸相对于葡萄糖的代谢偏好:（1）PDH通量仅为GLS和GDH催化的谷氨酰胺分解通量的1/2~1/4，（2）TCA分裂（ME/PEPCK）和葡萄糖异生通量在氨基酸存在下增加，从而限制葡萄糖通量进入TCA循环。在肥胖状态下，肝糖酵解通量和相应的TCA回复率提高了3-5倍。因此，在肥胖动物的肝细胞中，¹³C-葡萄糖和谷氨酰胺掺入FA的数量显著增加（图S7H和S7I）。

图S7 瘦小鼠和肥胖小鼠原代肝细胞中的葡萄糖通量

为了确定MASLD氨基酸代谢重编程的生理意义，作者采用化学和遗传方法评估谷氨酸和谷氨酰胺的代谢和产脂影响（图5a）。通过L-γ-谷氨酰对硝基苯胺（GPNA）抑制谷氨酰胺摄取导致原代肝细胞中甘油三酯积累的全面减少（图5B），其程度与FA合成抑制剂（乙酰辅酶A羧化酶抑制剂[ ACci ]）相似。更具体地说，上述通量分析揭示了肥胖小鼠肝细胞中两种主要谷氨酰胺分解代谢途径的失调: 转氨酶还原性羧化升高，而氧化脱氨作用被抑制，表明前者可能是谷氨酸驱动的DNL的主要途径（图5A和S7E-S7G）。通过乙酸氨氧基（AOA，图5C）或谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）抑制剂（GPTi）阻断转氨导致原代肝细胞中细胞内甘油三酯积累的进一步减少。相比之下，抑制氧化脱氨酶谷氨酸脱氢酶1（GLUD1）增加了细胞内脂质含量。此外，作者在肥胖小鼠肝脏中进行了病毒介导的敲低实验。结果显示广泛抑制谷氨酰胺分解（shGls2）和特异性抑制还原羧化（shIdh1）都显著降低了肝甘油三酯的积累（图5D）。

图5 IL-22Fc抑制Wnt-β-catenin信号传导

限制饮食蛋白质可减轻肝脏脂肪变性

为了进一步研究氨基酸驱动的DNL对MASLD的影响，作者让患有肝脏脂肪变性的肥胖小鼠自由进食标准或低蛋白饮食（LPD）（25%对5%千卡蛋白质）3周（图6A）。作者选择自由采食而不是配对采食是因为：（1）自由采食与NHANES更为相似；（2）配对采食不能保证向肝脏提供相同的底物，因此无法在体内对底物驱动的DNL效率进行头对头评估。

蛋白质限制减少了食物和水的消耗量，防止了体重增加（图6B和6C）。组织学分析表明，肝脏脂质积累减少（图6D），肝损伤减轻（图6E）。从机理上讲，LPD抑制了大多数致脂基因的表达，包括Scd1/2、Acly、Acss2、Fasn和Fabp5（图6F）。MASLD风险基因Pnpla3的表达也显著下调。相比之下，作为氨基酸剥夺标志的Fgf21被诱导了8倍多（图6F）。基因组富集分析（GSEA）证实，FA代谢是下调最多的途径（图6G和6H）。DNA复制和细胞周期也明显减弱（图6G）。相比之下，与核糖体和胆汁酸代谢相关的通路却上调了，这可能是一种补偿机制。

图6 低蛋白饮食可改善肝脏脂肪变性

总结

这项研究揭示了氨基酸可能成为脂肪肝的重要碳源，长期摄入过多可能加重肝脏负担，增加脂肪肝发生的风险。作者强调，现在将低蛋白饮食作为治疗脂肪肝的手段还为时尚早，还需要更多的研究来确认安全性、不同人的差异等。未来的研究必须区分和评估不同氨基酸作为DNL底物或MASLD生物学其他方面作用的相对贡献。总之，这项研究揭示了氨基酸在肝脏脂肪生成中的重要作用，并提出了一个以前未被重视的针对MASLD的营养干预目标。

参考文献

Liao Y, Chen Q, Liu L, Huang H, Sun J, Bai X, Jin C, Li H, Sun F, Xiao X, Zhang Y, Li J, Han W, Fu S. Amino acid is a major carbon source for hepatic lipogenesis. Cell Metab. 2024 Nov 5;36(11):2437-2448.e8. doi: 10.1016/j.cmet.2024.10.001