Cell | 雷公藤红素治疗肥胖症——有望成为世界首款减肥中药

2015年5月11日，哈佛医学院Umut Ozcan团队在《Cell》杂志发表题为“Treatment of obesity with celastrol"的文章。该研究使用计算机药物筛选方法，发现从雷公藤植物根部提取的五环三萜烯雷公藤红素（Celastrol）是一种强大的抗肥胖剂。雷公藤红素抑制食物摄入，阻止能量消耗的减少，并通过增加瘦素敏感性使高瘦素饮食诱导的肥胖 (DIO) 小鼠体重减轻高达 45%，但它在瘦素缺乏 (ob/ob) 和瘦素受体缺乏 (db/db) 小鼠模型中无效。这些结果表明雷公藤红素是一种瘦素增敏剂，是一种有前途的治疗肥胖症的药物。

Highlights•雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的天然化合物•雷公藤红素创建类似于那些减少内质网应激条件的表达谱•雷公藤红素是一种强大的瘦素增敏剂•雷公藤红素有潜力作为抗肥胖治疗剂摘要尽管现代医学取得了很大的进步，但还没有找到治疗肥胖的有效药物。20年前瘦素的发现为治疗肥胖带来了希望。然而，瘦素抵抗的发生一直是减轻以瘦素为中心的肥胖治疗的一大障碍。在本研究中，我们利用电脑模拟药物筛选方法，发现雷公藤红素（Celastrol）是一种从雷公藤根中提取的五环三萜，具有强大的抗肥胖作用。雷公藤红素通过增加瘦素敏感性，抑制摄食量，阻断能量消耗，使高瘦素饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠体重减轻45%，但在瘦素缺乏（ob/ob）和瘦素受体缺乏（db/db）小鼠模型中无效。这些结果表明，雷公藤红素是一种瘦素增敏剂和一种有前景的药物治疗肥胖。1.转录特征分析用于识别小分子瘦素敏化剂即使在没有XBP1的情况下，4-PBA也可减少内质网应激，这表明每种操作均通过独立的途径建立内质网稳态。基于此，我们首先试图确定肝脏的全基因组基因表达谱，这些肝脏来自4- pba处理的小鼠或肝脏特异性过表达XBP1S的肥胖小鼠。选择这些来自肝脏的表达谱有两个原因：(1)这两种情况都是在先前应激条件下通过不同机制建立的稳态ER状态的代表，(2)CMAP是基于从细胞系中获得的数据，这使得我们认为纳入肝脏芯片将增加我们识别小分子的机会，因为下丘脑是一个高度特化的组织。为了确定4-PBA调控的转录组，我们用载体或4-PBA处理了肥胖/肥胖小鼠及其瘦对照，然后分离两组小鼠的肝脏并提取RNA用于微阵列分析。同时，我们将表达xbp1s的腺病毒（Ad-XBP1S）或对照lacz的腺病毒（Ad-LacZ）注射到ob/ob小鼠的尾静脉中，然后分离并制备肝脏RNA用于微阵列分析。我们首先测定了4-PBA处理的瘦小鼠或ob/ob小鼠与溶剂处理的瘦小鼠或ob/ob小鼠肝脏基因表达水平的倍数变化，然后对XBP1S和lacz表达的ob/ob小鼠进行了相同的分析。从以上三个实验组中，我们分别选取50个上调和50个下调基因（图1A和1B），并将我们探针注释的小鼠基因标识转换为人类基因标识。首先，我们分析了使用4-PBA处理的瘦小鼠的基因阵列获得的CMAP结果的绝对富集分数。根据这一分析的结果，我们确定了雷公藤红素是最有希望的候选药物，从而启动了对雷公藤红素的研究（图1C）。随后，在获得了三个基因标签的CMAP中所有小分子的绝对富集分数分布后（图1C），我们还使用了一种新的方法，用单一维度度量值对小分子进行排序，该度量值由三个绝对富集分数计算得出（图1D）；该指标被定义为“绝对产品评分”，它代表三个富集评分组合中最高评分的值。该算法还得出了排名最高的小分子Celastrol，并证明了最初的观察结果（图1E）。我们随后使用了下丘脑的表达谱，下丘脑是瘦素作用的重要组织，也是瘦素抵抗的主要部位。我们首先比较了DIO小鼠下丘脑基因表达谱的阴性或阳性改变与瘦对照组的基因表达谱。与瘦小鼠相比，DIO小鼠下丘脑中上调和下调最多的50个基因被用于生成肥胖相关的下丘脑基因表达标签，称为下丘脑肥胖标签（图1F和图1G）。接下来，为了确定化学伴侣诱导的下丘脑基因表达模式的变化，DIO小鼠分为三个亚组，分别用生理盐水、4-PBA或TUDCA处理7天。为了生成一个与化学伴侣相关的标签，我们计算了4-PBA和tudca处理组中每个基因的变化倍数的几何均值（图1F和图1G）。我们将其定义为下丘脑伴侣标签（图1G）。通过CMAP计算每个标签富集分数的绝对值（图1H）。绝对产品评分再次将雷公藤红素列为数据库中最重要的化合物之一（图1I）。从图1J中肝脏和下丘脑的绝对乘积分数的合并分布可以看出，雷公藤红素是得分最高的小分子（一旦将肝脏和下丘脑实验的绝对乘积分数进一步相乘分析）（图1K）。

图1雷公藤红素作为潜在抗肥胖分子的鉴定

2.雷公藤红素改善饮食诱导的肥胖小鼠的肥胖

DIO小鼠分别腹腔注射溶剂或雷公藤红素。雷公藤红素显著降低DIO小鼠的体重，从47.53±1.0 g降至35.43±0.97 g（第1天与第15天相比，p < 0.001），之后体重稳定。在第3周末，接受celastrol的DIO小鼠的体重达到了34.38±1.06 g（图2A），相对于初始体重，体重下降了27.67%±1.48%（图2B）。溶剂对照组小鼠的体重无变化。在试验第1周期间，对照组的每日进食量为2.06±0.11 g，雷公藤红素治疗组减少至0.43±0.12 g，相当于减少了79%（图2C）。最后一周的食物摄入量增加与循环中的瘦素水平呈负相关，循环中的瘦素水平稳步下降，在3周治疗期结束时达到接近瘦的水平（图2D）。与溶剂治疗对照组相比，雷公藤红素治疗未改变DIO小鼠的瘦体重（图2E）。然而，雷公藤红素处理的小鼠的脂肪百分比显著（41.5%）低于溶剂处理组（图2F）。与DIO小鼠相反，瘦小鼠的循环瘦素水平非常低。基于以下事实，雷公藤红素诱导的体重减轻在治疗期开始时（此时DIO小鼠处于高瘦素血症状态）更有效，并且随着血浆瘦素水平下降，小鼠对雷公藤红素的反应停止，我们推断雷公藤红素对瘦小鼠的影响很小。与我们的预期一致，在对DIO小鼠有效的剂量下，雷公藤红素给药未显著降低瘦小鼠的体重（图2G和图2H）。相反，作为对照组，雷公藤红素处理的瘦小鼠体重继续增加（图2G和图2H）。此外，溶剂或雷公藤红素处理的瘦小鼠的进食量相同（图2I），并且瘦小鼠的血浆瘦素水平在治疗期间无变化（图2J）。在接受雷公藤红素治疗的瘦小鼠中，我们也未检测到瘦体重（图2K）或脂肪百分比（图2L）的任何变化。这些发现进一步支持了雷公藤红素是瘦素增敏剂的可能性。这种长期长期给药表明，首先，雷公藤红素不会对小鼠产生毒性作用，其次，它还抑制肥胖的发生。

图2雷公藤红素对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的抗肥胖作用

3.雷公藤红素是一种瘦素增敏剂

如果雷公藤红素确实是一种真正的瘦素增敏剂，那么它对ob/ob或db/db小鼠应该没有作用或只有很小的作用，这两种小鼠都缺乏瘦素的作用。因此，我们测试了雷公藤红素对ob/ob和db/db小鼠的影响。赋形剂处理的db/db小鼠在实验过程中增加了体重（图3A和3B）。重要的是，雷公藤红素治疗db/db小鼠未引起任何体重减轻，小鼠体重增加的量与溶剂治疗小鼠相似（图3A）。事实上，在治疗期结束时，接受雷公藤红素治疗的db/db小鼠的体重比初始体重增加了14.01%±0.68%（图3B）。在两组中，溶剂组和雷公藤红素组db/db小鼠的进食量（图3C）、瘦体重（图3D）、脂肪百分比（图3E）和瘦素水平（图3F）均无变化。我们接下来研究了雷公藤红素对肥胖/肥胖小鼠的影响。溶剂治疗的ob/ob小鼠体重继续增加（图3G和3H）。给ob/ob小鼠注射雷公藤红素后，在治疗的第一周体重略有下降，但这种下降很快得到补偿，试验结束后，两组动物的体重没有显著差异（图3G）。事实上，他们的体重在试验结束时略有增加（图3H）。在大多数独立实验队列中，ob/ob小鼠的摄食量在第1周期间出现了轻微但显著的减少，但尽管ob/ob小鼠的肥胖持续存在，但这种减少在治疗的第2周及之后迅速恢复正常（图3I）。此外，ob/ob小鼠的瘦体重（图3J）和脂肪百分比（图3K）也不受雷公藤红素治疗的影响。

图3 雷公藤红素对db/db或ob/ob小鼠的作用最小

4.口服雷公藤红素对DIO小鼠也有较强的抗肥胖作用

为了研究雷公藤红素口服给药是否也发挥其抗肥胖作用，我们通过灌胃给药。图4A及4B显示经口施用溶媒3周并未改变DIO小鼠之体重。然而，口服雷公藤红素对体重有显著影响，从第1天的49.85±0.97 g减少到第22天的27.15±1.37 g (p < 0.001)，相对于初始体重减少了45.4%±3.46%（图4B）。与溶剂治疗组相比，DIO小鼠的食物摄入也显著减少（图4C和S2E）。与各自的对照组相比，向lean（图4D-4F）、db/db（图4G-4I）和ob/ob（图4J-4L）小鼠口服雷公藤红素未引起体重或进食量的显著变化。

图4 口服雷公藤红素可降低DIO小鼠的体重和摄食量

5.雷公藤红素增强瘦素的作用我们推断，如果雷公藤红素在瘦小鼠中无效是由于循环中瘦素水平低，那么在用雷公藤红素预处理的瘦小鼠中给予外源性瘦素应该比在用药物预处理的对照组中给予瘦素产生更强的结局。因此，我们给瘦小鼠注射溶媒或雷公藤红素，随后给每组注射生理盐水或推注剂量的瘦素。图5A显示瘦素给药给瘦素（载体+瘦素）导致摄食显著减少（对应于载体+生理盐水组比载体+瘦素组减少41%）。接受雷公藤红素和瘦素的瘦老鼠比其他任何一组吃得都少；在雷公藤红素存在的情况下，瘦素诱导的食物摄入抑制相当于雷公藤红素+盐水组食物摄入减少62%（图5A）。瘦素给药（Vehicle+Leptin）导致瘦小鼠体重显著下降（Vehicle+Saline vs . Vehicle+Leptin, p < 0.01），但雷公藤红素单独给药（Celastrol+Saline）没有引起瘦小鼠体重的显著变化（Vehicle+Saline vs . Celastrol+Saline, p = 0.10）。给予雷公藤红素预处理的瘦小鼠瘦素导致体重下降1.87±0.32 g。这些结果表明，在雷公藤红素预处理的小鼠中，瘦素诱导的体重平均下降了1.63 g，而在溶剂预处理的小鼠中，体重下降了0.63 g，这表明雷公藤红素增强了瘦素在瘦小鼠中减轻体重的作用（图5B）。为了研究雷公藤红素是否也能急性增强外源性瘦素对DIO小鼠的厌食和减重作用，我们测试了这些动物在雷公藤红素存在和不存在的情况下对瘦素的反应。与对照组相比，给予DIO小鼠瘦素并没有显著改变其摄食量。单独使用雷公藤红素可以降低DIO小鼠的摄食量（Vehicle+Saline与雷公藤红素+Saline相比，p < 0.001），而使用雷公藤红素（Celastrol+ leptin）预处理的DIO小鼠的摄食量相对于雷公藤红素+Saline组进一步降低（p < 0.01）（图5C）。此外，瘦素单独治疗并没有显著改变DIO小鼠的体重（图5D），而雷公藤红素治疗导致DIO小鼠的体重下降了0.86±0.15 g (Vehicle+Saline vs .雷公藤红素+Saline， p < 0.001)（图5D）。在雷公藤红素存在的情况下给予瘦素（雷公藤红素+瘦素组）证明雷公藤红素进一步增强瘦素对体重的负面影响；雷公藤红素+瘦素组DIO小鼠体重下降（1.42±0.19）g，明显低于其他各组（图5D）。为了进一步证明雷公藤红素作为瘦素增敏剂的生理作用，我们测试了雷公藤红素是否能进一步上调肥胖/肥胖小鼠瘦素的作用。如图5E所示，低剂量的瘦素本身对ob/ob小鼠的体重增长没有明显的影响。然而，在雷公藤红素存在的情况下给予相同剂量的瘦素，在治疗过程中体重明显下降，ob/ob小鼠初始体重下降了15.36%±2.61%（与其他各组相比p < 0.001）（图5E）。同时给予瘦素和雷公藤红素可使摄食抑制增加2倍（与雷公藤红素组相比，瘦素诱导的摄食抑制%，p < 0.001），这表明即使在ob/ob小鼠中，雷公藤红素也能增强瘦素的厌食作用（图5F）。

图5 雷公藤红素作为瘦素增敏剂的作用

6.雷公藤红素激活DIO小鼠下丘脑瘦素受体- stat3通路

接下来，我们研究了雷公藤红素处理后的瘦素受体信号网络。为了阐明雷公藤红素是否增加下丘脑对瘦素的敏感性，我们分析了雷公藤红素如何在肥胖和高瘦素血症的DIO小鼠中影响瘦素刺激的STAT3Tyr705磷酸化。在溶剂处理的DIO小鼠中注射这种激素并未导致STAT3Tyr705磷酸化的显著增加（图6A和6B），但单独雷公藤红素治疗确实导致下丘脑中STAT3Tyr705磷酸化的基础水平显著增加（图6A和6B）。然而，当用雷公藤红素预处理的DIO小鼠给予瘦素时，下丘脑中的p-STAT3Tyr705水平进一步增加（图6A和6B），这表明即使用单剂量雷公藤红素对DIO小鼠进行治疗，也足以增加瘦素的敏感性。我们接下来研究了下丘脑的前阿片黑素皮质素（POMC），刺鼠相关肽（AGRP）和神经肽Y （NPY）的mRNA水平。令人惊讶的是，我们没有发现POMC的mRNA水平在溶剂和雷公藤红素处理的小鼠之间有任何差异（图6C）。此外，我们发现与一般预期完全相反的AGRP表达水平显著增加（图6D）。然而，NPY mRNA水平没有改变（图6E）。此外，与对照组相比，在celastrol处理的DIO小鼠中，细胞因子信号转导抑制因子3 （SOCS3）的表达水平显著升高（图6F）。接下来，我们研究了雷公藤红素对DIO小鼠下丘脑内质网应激状态的影响。雷公藤红素治疗小鼠导致PERK磷酸化显著降低，表明雷公藤红素可降低内质网应激（图6G）。此外，我们还用雷公藤红素处理结节性硬化症2 （TSC2）敲除（TSC2 - / -）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。雷公藤红素对TSC2 - / -细胞的处理表明，在这一体外系统中，雷公藤红素也可降低PERK磷酸化，从而降低内质网应激。此外，对SERCA2B水平的分析也表明，在celastrol治疗的小鼠的下丘脑中显著降低（图6H和6I）。

图6 雷公藤红素增强瘦素信号传导并减少内质网应激

7.雷公藤红素治疗小鼠的能量稳态

据报道，瘦素即使减少食物摄入也能维持高能量消耗。基于以上数据，我们推断，尽管雷公藤红素对摄食和体重有稳健的影响，但它会增加能量消耗，导致脂肪被利用为主要的能量来源。因此，我们测定了溶剂和雷公藤红素处理的小鼠的代谢参数（能量消耗[EE]、呼吸交换比[RER]和体力活动水平）。在暗循环中，溶剂组和雷公藤红素处理组之间的EE无差异（图7A）。然而，雷公藤红素处理的小鼠的EE在光循环中较高（图7A）。此外，在雷公藤红素处理的DIO小鼠中，在暗循环和光循环中，RER值均显著降低（图7B）。雷公藤红素给药使DIO小鼠在暗期的体力活动水平显著降低，但在光期未观察到差异（图7C）。雷公藤红素治疗组在黑暗周期中体力活动的减少可能是由于食物搜寻行为的减少。我们还测定了瘦小鼠的代谢参数。在雷公藤红素治疗的瘦小鼠中，暗循环中的EE略有但显著减少（图7D）。相对于溶剂治疗，雷公藤红素确实降低了暗期的RER值（图7E）。此外，与对照组相比，雷公藤红素导致他们在暗周期的体力活动显著减少（图7F）。我们还分析了雷公藤红素对ob/ob和db/db小鼠模型的影响。令人惊讶的是，在两个周期中，给ob/ob小鼠急性给予雷公藤红素均导致EE略有但显著减少（图7G）。RER值在暗期也显著降低（图7H），这伴随着体力活动的减少（图7I）。在celastrol处理的db/db小鼠中，EE也显著降低（图7J）。然而，在db/db小鼠中，RER值和体力活动没有改变（图7K和7L）。

图7 雷公藤红素对代谢指标的影响

结论

雷公藤红素是一种在雷神藤的根部发现的天然化合物，它能增加瘦素的敏感性，从而抑制食物摄入，并显著减轻肥胖小鼠的体重。

Liu J, Lee J, Salazar Hernandez MA, Mazitschek R, Ozcan U. Treatment of obesity with celastrol. Cell. 2015 May 21;161(5):999-1011. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.011.

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