双歧杆菌对艰难梭菌的抗菌活性

        大量临床数据表明，某些益生菌会影响CDI治疗。因此，由于其巨大的潜力，特别是在药用应用中，益生菌受到了极大的关注。先前的研究表明，某些益生菌，例如嗜热链球菌，双歧杆菌长杆菌抑制了艰难梭菌的体外和体内的生长。这些菌株对艰难梭菌的抗菌作用主要反映在抑制生长，芽孢形成和毒素降解。但是，很少有研究集中在艰难梭菌的细胞水平上的变化上。2019年由上海交通大学杨景鹏博士团队在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology发表了题为Antibacterial Activity of Bifidobacterium breve Against Clostridioides difficiled的研究性论文。在这项研究中，艰难梭菌ATCC 9689（CD）用双歧杆菌Breve的无细胞培养物（YH68-CFCS）处理。进行了全面的研究，以探索CD的生长，芽孢形成，毒素的产生和毒力基因表达水平，尤其是质子动力（PMF）的变化，CD的细胞质膜的渗透性和完整性，以说明 YH68-CFCS对CD的抗菌活性在体外。CFCS的抑制区达到19.10±0.54mm，比细胞颗粒（7.25±0.21mm）和无菌盐水（7.00±0.00mm）（P <0.05）大得多。这一发现表明YH68-CFCS含有主要的抗菌物质。因此，YH68-CFCS用于后续实验。在生理指标测定的基础上，探讨 YH68-CFCS 对 CD的抑制作用。在 YH68-CFCS 存在下和对照中 CD 的生长在 12 小时内表现出稳定增加。然后，这种上升趋势被终止，取而代之的是下降趋势，直到 48 小时。在 24 小时和 48 小时检测到 CD 产生的芽孢。YH68-CFCS 处理的 CD 细胞密度和芽孢产生量在 24 h 时分别达到 7.11 ± 0.09 lg CFU/mL 和 8.40 ± 1.53 个芽孢/mL，在 48 h 时分别达到 7.16 ± 0.14 lg CFU/mL 和 4.50 ± 1.95 个芽孢/mL。YH68-CFCS 处理的 CD 值均小于对照，表明 YH68 -CFCS 对 CD 的生长和芽孢产生具有更强的抑制作用。

        用 YH68-CFCS 处理 CD 以探讨其毒素产生是否受到抑制，毒力基因表达水平是否下调。结果显示，在 12 小时之前未检测到毒素 A/B，而在较早的时间点检测到 tcdA 和 tcdB 的表达。数据显示，YH68-CFCS 处理组在 24 小时毒素 A/B 产生达到 445.62 ± 7.24 ng/mL，在 48 小时达到 179.45  0.00 ng/mL，远低于对照组的值（p < 0.05）。YH68-CFCS 处理 CD 中 tcdA/B 的基因表达水平降低，tcdA 的倍数变化在 24 小时为 3.14 倍 （对照组为 8.31 倍），在 48 小时为 1.70 倍 （对照组为 7.77 倍）（p < 0.05）；对于 tcdB，24 小时时倍数变化为 1.70 倍 （对照为 4.63 倍），48 小时时倍数变化为 0.14 倍 （对照为 2.40 倍） （P < 0.05）。根据 CD 中 tcdA/B 的毒素产生量和基因表达水平，YH68的 CFCS 显著降低了毒素的产生和毒力基因表达的降低，这表明 YH68-CFCS 在毒素产生方面对 CD 具有抑制作用。

        采用 FT-IR 光谱分析探讨 YH68-CFCS 处理或不处理 CD 细胞的主要化合物变化。来自对照组和 YH68-CFCS 处理组的细胞沉淀的 FT-IR 光谱。这两个光谱在 3,401–3,428 cm^-1 处都有宽而强的波段，对应于 O-H 和 NH 键的拉伸振动。2,925-2,962 和 1,646-1,650 cm^-1 处的强带分别表示存在 CH（-CH2、-CH3）和 C=C 拉伸振动。1,454-1,550 cm^-1 和 1,398-1,401 cm^-1 处的强带分别表明存在苯骨架和异质芳纶振动。1,072-1,236 和 665-831 cm^-1 处的吸收峰分别表示苯环中的弯曲振动（P = O，P = S）和 C-H 弯曲振动。此外，FT-IR 光谱在 501-532 cm^-1 处有许多吸收峰（表示 C-Br 化合物组）。以前的研究表明，2,800-3,000 cm^-1 处的强条带对应于细胞膜中脂肪酸的吸收峰;位于 1,500-1,800 cm^-1 处的那些代表氨基酸和氨基酸的特征峰;在 1,200-1,500 cm^-1 处的那些表明存在含有蛋白质和磷酸基团的化合物;900-1,200 cm-1 处的多糖是细胞壁中多糖的吸收峰。

       就峰偏移而言，存在于对照光谱中的 1,454 和 1,542 cm^-1 处的吸收峰在用 YH68-CFCS 处理的 CD 光谱中不存在。在峰面积方面，在 1,500-1,800、1,200-1,500 和 900-1,200 cm^-1 处观察到 3 个显著变化，这表明 YH68-CFCS 诱导了 CD 细胞结构的显着变化。这些数据表明，YH68-CFCS 对 CD 细胞造成严重损伤，包括细胞膜和细胞壁的变化。

      细胞形态的变化是最直观的表现。SEM 用于确定 YH68-CFCS 是否极大地改变了 CD 的细胞结构。随着时间的推移，用 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞表现出缩小的形状、细胞质泄漏和溶解的细胞壁，与对照完整细胞的形态形成鲜明对比。具体来说，CD 的细胞形态发生了很大变化，包括细胞表面形态的变化和细胞壁在 2 和 3 h 的溶解。这些 SEM 图像是 YH68-CFCS 在 3 小时内诱导 CD 细胞损伤的视觉证明。

       CD 细胞的细胞膜通透性被 YH68-CFCS 改变和破坏后，CD 细胞中的 K+ 水平和无机磷酸盐含量变化很大。测量 CD 的细胞内和细胞外 K+ 水平和无机磷酸盐含量，以确定 YH68-CFCS 是否对细胞膜通透性有影响。对照中 CD 细胞的 K+ 水平在 3 小时内稳定 （细胞内 K+ 为 530 ppm，细胞外 K+ 为 45 ppm），而用 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞的细胞内 K+ 水平显着降低（3 小时时为 236.2 ppm）（p < 0.05）;随后，细胞外 K+ 水平增加，在 3 小时时达到 452.4 ppm。在 CD 的无机磷酸盐含量中观察到类似的变化。随着时间的推移，对照 CD 细胞的细胞内无机磷酸盐含量稳定在 0 μmol/L （细胞外含量稳定在 58 μmol/L），而 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞的细胞内含量在 3 h 时下降到 16.59 μmol/L （细胞外含量增加到 31.68 μmol/L） （p < 0.05）。这些结果表明，YH68-CFCS 诱导 CD 细胞膜通透性发生显着变化，随后导致细胞内 K+ 和无机磷酸盐泄漏，最终导致 CD 损伤。

       YH68-CFCS破坏了 CD 的细胞膜完整性，随后在细胞膜上形成几个孔，伴随着 ATP、核酸和蛋白质物质从细胞内部释放。测定 CD 细胞中 ATP （发光值） 和紫外线吸收物质 （OD 260/280 值） 水平的变化，并将其视为细胞溶解和随机孔形成的指标。对于对照，细胞内和细胞外 ATP 水平略有变化，细胞内和细胞外发光值在 3 小时内分别稳定在 40,000 和 3,500 RLU，表明 CD 的细胞膜几乎完好无损。然而，用 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞的细胞内发光值急剧下降，在 3 小时时达到 10,566 RLU（p < 0.05），同时，细胞外发光水平增加到 35,604 RLU（p < 0.05），表明 CD 细胞膜受损，伴有细胞内 ATP 泄漏。同时，与对照相比，核酸和蛋白质从用 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞中排出，在 3 小时内表现出吸光度值增加（图 7）。这些结果表明，CD 的细胞膜在短时间内被 YH68-CFCS 破坏。随后，CLSM 与荧光染料 SYTO 9 和 PI 相结合，从直观的存活率角度进一步确认 CD 细胞的损伤。通常，所有细菌细胞都可以用 SYTO 9 染色。只有膜被破坏的细胞才能被 PI 穿透，这可以降低 SYTO 9 荧光的强度。正常的细菌细胞膜是完整的，可以排除 PI，但允许 SYTO 9 进入，伴随着绿色荧光的激发;然而，细菌细胞受损的膜可以在红色荧光的激发下被 PI 染色。随着时间的推移，用 YH68-CFCS 处理后，CD 细胞的绿色和红色荧光强度逐渐发生变化。对照细胞 （用 85% 无菌盐水处理） 在 3 小时内激发透明绿色荧光，几乎没有红色荧光，表明 SYTO 9 浸润和 PI 受阻。相比之下，用 YH68-CFCS 处理的 CD 细胞的绿色荧光强度在 2 小时后降低，而红色荧光的强度增加，占很大比例 （与 1 小时相比） 处理的细胞膜完整性丧失。三小时后，几乎所有处理过的 CD 细胞都表现出红色荧光，而不是绿色。上述数据表明，CD 细胞膜在 YH68-CFCS 处理下受损，这种破坏是一个进行的过程。

      在这项研究中，CD能被YH68-CFCS显著抑制和破坏。YH68-CFCS 对 CD 的抗菌活性包括抑制生长、芽孢和毒素的产生以及毒力基因的表达；同时，细胞水平的变化反映在膜通透性增加、细胞膜孔形成、膜完整性改变和细胞完全崩解。以上结果表明，艰难梭菌 ATCC 9689 被短双歧杆菌 YH68-CFCS 破坏，主要依赖于生理活动的有害干预和对细胞形态的直接损伤。

     参考文献：Yang J, Yang H. Antibacterial Activity of Bifidobacterium breve Against Clostridioides difficile. Front Cell Infect Microbiol. 2019 Aug 7;9:288. doi: 10.3389/fcimb.2019.00288. PMID: 31440478; PMCID: PMC6693512.