最新发现，AKK可以预防睡眠不足引起的记忆力下降！

  睡眠障碍在现代社会的成年人中很常见。缺乏恢复性睡眠会对大脑和身体机能产生不利影响。累积的证据表明，睡眠剥夺(SD)可能诱发认知能力下降，例如注意力丧失，记忆障碍，认知能力下降，甚至增加痴呆的风险。然而，SD诱导的认知功能障碍的潜在机制以及有效的临床可用疗法仍然缺乏。

  最近的研究表明，睡眠不足/剥夺会改变人类和啮齿动物肠道微生物群的组成。越来越多的证据表明，肠道微生物群-脑轴在急性和慢性脑部疾病中起着至关重要的作用。更好的睡眠质量可能与健康老年人更好的认知表现有关。肠道生态失调会导致SD引起的外周和中枢炎症以及认知受损。然而，这些现象背后的机制仍未得到充分探索。

  2023年9月6日，西安交通大学第一附属医院脑科学研究中心王强教授和许静及团队在Gut Microbes发表最新研究性文章：Akkermansia muciniphila supplementation prevents cognitive impairment in sleep-deprived mice by modulating microglial engulfment of synapses。该研究表明睡眠剥夺小鼠体内Akk菌丰度显著下降，而回补Akk可通过增加短链脂肪酸含量和维持小胶质细胞稳态，从而改善睡眠剥夺引起的认知障碍。

  测试抗生素或载体预处理对SD诱导的小鼠认知障碍的影响(图1a)。抗生素处理小鼠14天。SD在第15-21天诱导。SD 7 天后，使用旷场实验、高架十字迷宫、新型物体识别和 Y 迷宫测试行为表现。与对照组相比，SD小鼠的探索时间显着减少(图1b,c)，SD小鼠Y迷宫中的自发改变指数也降低(图1e,f)。接受抗生素治疗的SD小鼠在新型物体识别测试中表现出较差的性能(图1b,c)，且自发交替指数降低。 NOR和Y迷宫测试的总距离在组间相似(图1d,f)。表明，在SD之前破坏肠道微生物群会加重SD小鼠的认知障碍。

  图1. 抗生素预处理对SD小鼠认知能力的影响。

  图2. 粪菌移植对小鼠认知能力的影响

  为了检查SD相关的肠道微生物组是否与认知障碍有关，将睡眠剥夺小鼠或正常睡眠(对照)小鼠的粪便微生物群移植到用抗生素预处理的5周龄小鼠中,评估认知功能(图2a)。与接受对照小鼠微生物群(rCon)的小鼠相比，接受SD小鼠微生物群(rSD)的小鼠对新对象的偏好降低(图2b-d)，自发交替指数较低(图2f-h)。在NOR和Y迷宫场中行进总距离相似(图2e和i)。结果表明，来自SD小鼠的肠道微生物群移植诱导受体小鼠的认知障碍。

  为阐明肠道微生物群如何影响SD小鼠的大脑功能，使用16S rDNA测序评估SD小鼠和对照的粪便微生物组组成(图3a)。主坐标分析(PCoA)显示SD和对照小鼠之间存在显着差异(图3b)，但OTU总数无显著变化(图3c)。与对照组相比，SD小鼠肠道微生物群的β多样性显着降低(图3d)。 从LEfSe分析获得的分类分支图如图3e所示。计算了每组中细菌分类群的百分比(图3f)。杆菌、β变形杆菌和鞘杆菌明显减少。然而，梭状芽胞杆菌在SD组中明显富集(图3f)。SD小鼠中A. muciniphila的相对丰度低于对照组(图3g)。通过qPCR验证了A. muciniphila的变化。结果显示，SD7天后小鼠盲肠含量显着降低(图3h)。数据表明，SD会改变肠道微生物群并降低A. muciniphila的含量。

  图3. SD改变小鼠肠道微生物组成。

  图4. 补充A. muciniphila恢复SD诱导认知缺陷.

  为评估补充A. muciniphila是否可预防SD诱导的认知障碍，抗生素预处理后，通过口服强饲法向C57BL/6小鼠补充A. muciniphila(ATCC BAA-6)或其储存缓冲液(PBS)(图4a)。使用qPCR定量盲肠内容物中A. muciniphila。结果表明，口服后A. muciniphila定植显著增加。NOR测试表明，A. muciniphila预处理可防止SD小鼠新事物识别的探索时间减少(图4b，c)。Y迷宫结果表明，SD小鼠的自发交替指数下降也被A. muciniphila预处理所抑制(图4e，f)。在NOR和Y迷宫测试中行进的总距离在两组之间相似(图4d和g)。结果强调补充A. muciniphila作为SD诱导的小鼠认知障碍的可能预防性治疗的功效。

  为了探索补充A. muciniphila如何减轻SD诱导的认知障碍，使用蛋白质印迹评估海马体中突触蛋白VGLUT1(兴奋性突触前元件标志物)和PSD-95(突触后标志物)的表达(图5a)。结果表明，与对照组相比，SD小鼠的VGLUT1和PSD-95蛋白水平显着降低。A. muciniphila给药阻止了SD小鼠的突触丢失(图5b-d)。通过免疫荧光染色检测齿状回中SYP，VGLUT1和PSD-95的免疫密度(图5e-g)。SD/V 组中 SYP、VGLUT1、PSD-95 和 VGLUT1/PSD-95 共定位的密度显着降低，而A. muciniphila治疗阻断了这些变化(图 5h–k)。表明，补充AKK可以阻止SD小鼠齿状回中的突触缺失。

  图5. 补充A. muciniphila减轻SD小鼠突触损失。

  图6. 补充A. muciniphila抑制 SD 小鼠海马体中广泛的小胶质细胞活化和突触吞噬.

  评估7天SD是否激活小鼠海马中的小胶质细胞以及A. muciniphila预处理是否调节其激活，对Iba1(一种公认的小胶质细胞标志物)进行免疫荧光染色，并量化海马体中的小胶质细胞密度(图6a)。SD显着增加小鼠海马中的Iba1阳性染色，而AKK预处理显着降低小胶质细胞活化(图6a，b)。补体蛋白C1q是小胶质细胞修剪和突触吞噬的关键蛋白，免疫染色评估C1q表达。结果显示，与对照组相比，SD/V小鼠的C1q免疫反应性升高。AKK处理显着降低SD后小鼠海马体C1q表达(图6c，d)。溶酶体标志物CD68评估海马体小胶质细胞的吞噬活性。CD68阳性溶酶体在SD / V小鼠的小胶质细胞中积累，AKK预处理显着降低SD小鼠小胶质细胞中的CD68阳性染色(图6e-g)。在SD / V小鼠的Iba1+小胶质细胞中发现SYP点的数量增加。AKK预处理阻止该变化(图6h，i)。结果表明，给予A. muciniphila可抑制SD后小鼠海马体中小胶质细胞过度激活和突触吞噬。

  AKK治疗4周，各组体重相似(图7a)。治疗第三周开始，补充AKK小鼠的食物摄入量低于对照组(图7b)。非靶向代谢组分析SD后补充AKK和载体的小鼠血清中差异代谢物。主坐标分析(PCA)显示PC1的方差评分为25.5%，PC2为12.9%(图7c)。与Con / V组相比，SD / V组代谢物5种下调和8种上调(图7d)。与SD / V组相比，SD / AKK组代谢物5种下调，4种上调(图7e)。与Con / V组相比，SD / AKK组代谢物7种下调和7种上调。SD / V和SD / AKK组中血清中代谢物的富集如图7f，g所示。乙酸盐和丁酸在SD / V小鼠中显着降低，AKK预处理阻止这种变化(图7h，i)。

  血清乙酸盐和丁酸水平与探索时间呈正相关(图7j，k)。靶向代谢组显示，SD小鼠的乙酸盐和丁酸血清浓度降低，口服AKK显着恢复(图7l，m)。测试预补充乙酸盐和丁酸对SD小鼠的影响。NOR测试表明，SCFAs预处理可防止SD小鼠探索新对象的减少。Y迷宫表明，SCFAs预处理阻断SD小鼠中观察到的自发交替指数下降。表明SCFAs预处理缓解了SD诱导的认知障碍。结果说明，AKK治疗恢复了乙酸和丁酸水平，这可能是其对SD诱导的认知功能障碍的保护作用的基础。

  图7. A. muciniphila定植对小鼠代谢功能障碍相关SD的影响。

  图8. SCFAs通过在体外抑制小胶质细胞的突触吞噬来减轻突触损失。

  验证SCFAs恢复介导减少的小胶质细胞活化和突触吞噬，对小鼠海马体中的Iba1 / CD68和Iba1 / SYP进行了双免疫荧光染色。数据显示，SCFAs预处理显著降低SD小鼠海马体中的Iba1阳性染色，也导致Iba68+小胶质细胞内CD1阳性点的减少。与SD/V小鼠相比，SCFAs预处理SD / V小鼠Iba1+小胶质细胞中的SYP阳性点数也减少。采用培养的初级小胶质细胞的LPS刺激模型来模拟SD后的小胶质细胞活化(图8a)。与Con/V相比，LPS刺激的小胶质细胞表现出更大的Iba1阳性细胞体面积，而SCFAs抑制LPS刺激诱导的变化(图8c，d)。用LPS处理的小胶质细胞中CD68阳性溶酶体的积累增强，用LPS加SCFAs处理的小胶质细胞中似乎减少(图8c-e)。结果表明，在LPS诱导的炎症过程中，SCFAs可能抑制小胶质细胞的吞噬活性。

  与SD / V组相比，用SCFAs预处理的SD小鼠的VGLUT1和PSD-95蛋白水平显着增加。研究SCFAs对小胶质细胞的突触吞噬来预防突触丢失影响。使用共培养系统，将小胶质细胞添加到体外培养7天的原代神经元中。在LPS处理前15分钟将SCFAs预先施用于共培养系统。24小时后，固定细胞进行免疫染色(图8b)。神经元-小胶质细胞共培养物的定量分析显示，与对照神经元相比，用LPS处理的神经元/小胶质细胞中的突触素密度降低(图8f，g)。与对照细胞相比，在用LPS处理的共培养物中发现小胶质细胞内突触素阳性点显着增加。用SCFAs预处理阻止了共培养的变化(图8f-h)。在原代培养神经元中，LPS处理没有改变VGLUT1或PSD95表达，表明神经元外的其他必要因素是导致突触丢失的原因。相比之下，与对照神经元相比，与LPS共培养的神经元/小胶质细胞中的VGLUT1和PSD95显着降低。SCFAs给药显着挽救了LPS刺激后神经元/小胶质细胞共培养物中的VGLUT1和PSD95表达(图8i和k)。结果表明，SCFAs通过抑制小胶质细胞的突触吞噬来防止突触丢失。

  该研究发现肠道微生物群的生态失调会导致患有认知障碍的SD小鼠的海马突触丢失。补充A. muciniphila可缓解认知功能障碍，防止海马体中小胶质细胞的突触吞噬作用。与此同时，微生物组相关代谢物、乙酸盐和丁酸的血清水平得以恢复。另一方面，还发现SCFAs预处理可改善SD小鼠的认知障碍并减少小胶质细胞活化和突触吞噬。此外，研究结果表明，SCFAs通过减少小胶质细胞-神经元共培养中小胶质细胞的突触吞噬来预防突触丢失。认为有必要进一步研究A. muciniphila在预防人类睡眠障碍引起的认知障碍方面的潜在益处。最后，研究结果强调了SCFAs在维持小胶质细胞稳态对抗神经炎症刺激方面的重要作用。大脑中SCFAs水平紊乱可能是多种神经退行性疾病的关键病理过程。