营养压力可成为开发新抗生素的靶点

面对泛耐药革兰氏阴性致病菌的威胁和预防不断增加的不可医治感染病例，开发新的方法迫在眉睫。细菌养分胁迫抑制剂是未来抗生素发展中具有高潜力的候选药物。氨基酸、核苷酸和维生素的生物合成途径不管是在实验室还是在宿主的营养限制条件下都对细菌的生长至关重要。对各种合成化合物和天然产物的高通量筛选已经发现了营养物质生物合成的抑制剂。这篇综述就细菌营养物质的合成及其在宿主感染过程中的作用做了总结。此外，作者探索了用于寻找这些靶标抑制剂的筛选平台，并重点突出这些平台的成功案例。最后，作者重点介绍了细菌营养物质生物合成、抗生素活性和抗生素耐药性之间联系。

1. 细菌营养物质的生物合成

在大肠杆菌等细菌中，细菌复制需要碳源、氮源、硫酸盐、无机磷酸盐、盐和痕量金属。细菌必须从外部环境或通过它们自身的生物合成获取营养物质，例如核碱基、氨基酸和维生素。这些营养物质生物合成途径密切相关，并共享几个源自糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径的关键中间体。大肠杆菌代谢已被广泛表征，可以用作许多代谢途径的代表性物种。尽管在识别非经典途径方面仍然存在差距，但利用比较基因组预测可以评估测序细菌的生物合成能力。许多氨基酸和维生素生物合成途径在细菌中非常保守，且在人体中没有同源物（谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、核苷酸和叶酸途径除外，它们至少部分存在于人体中），这对于抗菌药物的发现工作很有希望。并且，它们在选择性靶向细菌或人体中酶的能力已在核苷酸、氨基酸，和维生素生物合成中被报道。

图1 氨基酸、核苷酸和维生素的生物合成途径及其在致病细菌和人类间的保守性示意图

2. 核苷酸生物合成

由于20世50 年代初期的研究，嘌呤从头生物合成首次作为沙门氏菌属的适应性决定因素出现。腺嘌呤特异性生物合成基因（purA和purB）的突变导致无毒菌株，鸟嘌呤（guaA或guaB）或嘌呤生物合成非特异性基因（purC、purD、purE、purF、purH、purL和purM）的突变体降低毒力。从那以后，在各种细菌病原体中证明了嘌呤生物合成在细胞内复制过程中是必不可少的，包括伤寒沙门氏菌、沙门氏菌鼠伤寒和结核分枝杆菌。事实上，嘌呤生物合成突变体已被用于动物模型和人体中制备针对这些致病菌的减毒活疫苗。且嘧啶生物合成被证明对感染期间的鼠伤寒沙门氏菌至关重要，显示毒力降低。同样地，核苷酸生物合成已被证明对血液、脓肿、骨髓炎、肺炎和菌血症中金黄色葡萄球菌的存活至关重要。总的来说，核苷酸生物合成是一个靶标，这使得在各种感染部位中使致病菌成为最优先的菌株。

3. 氨基酸生物合成

几种氨基酸生物合成途径已被确定为具有潜力的抗菌靶标，它们在致病菌中的分布上具有显著差异。芳香族氨基酸生物合成营养缺陷型是最早在鼠伤寒沙门氏菌和伤寒杆菌中进行减毒活疫苗试验的成功案例之一，并且后来用于结核分枝杆菌疫苗。同样，芳香族氨基酸生物合成已被确定在金黄色葡萄球菌中是可行的靶标。芳香族氨基酸来源于共同的前体分支酸，分支酸也是对氨基苯甲酸（PABA）和铁载体合成所必需的。因此，在金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和伤寒杆菌中，人们认为分支酸作为PABA生物合成前体的作用是造成适应性缺陷的原因。相比之下，分支酸被证明对肺炎克雷伯菌的肺部感染很重要，因为它是合成芳香族氨基酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的中间体。同样，支链氨基酸对鲍曼不动杆菌和克雷伯氏菌至关重要，特别是在肺部感染环境中，克雷伯氏菌中的ilvC或ilvD敲除在竞争性感染模型中对肺部的细菌负荷减少了大约100倍。同样，leuA的缺失导致免疫功能低下小鼠肺部细菌负荷减少1000倍。

4. 被低估的营养压力靶标

随着RNA-Seq技术的发展，研究人体感染期间致病菌的细菌代谢成为可能，也能够探究致病菌在人类感染期间转录。然而，转录组在预测适应性方面的应用仍不清楚。在铜绿假单胞菌急性烧伤伤口和慢性伤口小鼠感染中，除了代谢基因外，基因表达与突变适应性之间并没有相关性。事实上，探索人体环境中细菌基因表达的研究可能最适合评估人体和小鼠宿主之间代谢途径作用的差异。比较人体和小鼠的转录组学特征可用于验证小鼠感染模型。例如，小鼠铜绿假单胞菌手术伤口感染的转录组学特征与人类感染之间存在很强的相关性，表明小鼠疾病模型成功地复制了宿主环境。然而，铜绿假单胞菌肺和烧伤模型的转录谱与人体感染中的基因表达无关。作者预计这些类型的研究可以识别人体和小鼠环境之间的差异，从而开发出更好的体外或动物感染模型。类似于现有的实验室模型，可以通过评估模型性能来改进，同时改变实验条件，例如感染的途径或慢性、微生物群组成或动物的饮食或环境（例如压力或温度）。此外，对基因编辑或人源化小鼠的证据探索可能是捕捉人体条件的必要条件。

5. 发现营养胁迫抑制剂的策略

最初开发细菌营养物生物合成抑制剂主要集中在基于靶标的生化筛选。这些努力在提供具有抗全细胞活性的化合物方面取得了有限的成功。然而，对结核分枝杆菌生物素生物合成蛋白BioA进行生化筛选后，进行了二次测定，该测定鉴定了生物素生物合成的全细胞活性抑制剂，小鼠感染模型中的活性尚未得到证实。总之，体外生化筛选已证明在实现全细胞活性方面基本上不成功。相比之下，在营养有限的培养基中筛选抑制细菌生长的方法已被证明可以有效地识别营养生物合成的全细胞活性抑制剂。目标识别是大多数全细胞生长抑制筛选的一个重要限制。在营养有限的培养基中进行筛选具有快速生成目标化合物，这是通过系统地检查抑制全细胞活性化合物生长抑制作用的营养条件来完成的。称为代谢物抑制，该技术使用一系列初级代谢物，可以筛选出对抑制分子的抗性，以快速识别目标生物合成途径代谢物抑制可以补充传统的目标识别技术，例如产生抗性突变体、敲除文库、酶测定或多拷贝抑制。

图2 在抗生素开发中利用营养压力的筛选策略和位点特异性靶点

6. 营养生物合成抑制剂

Prontosil是一种磺胺类药物，是第一种用于治疗人类感染的抗生素，也是临床上唯一使用过的营养生物合成抑制剂。磺胺类药物的活性在营养丰富的培养基中由于PABA被减弱，但它们在营养有限的感染环境中仍然活跃。尽管筛选方案需要改变，但只有少数方法使用了营养限制条件。成功的筛选与创新性的小分子筛选靶标的验证相结合，将得到具有潜力的小分子。

7. 营养胁迫与抗生素耐药性之间的联系

抗生素耐药性是一个资源密集型过程，通常与适应性代偿相关，包括代谢表型和生长动力学的系统级变化。细菌耐受性或持久性与抗生素耐药性的发展之间的联系已经确立。几个小组已经证明了特定营养素刺激新陈代谢、恢复耐受性种群和恢复抗菌敏感性的能力。同样，营养生物合成的缺陷已被证明可以抑制抗生素的持久性，因此代表了一种增强抗生素活性的策略。具体来说，在耐抗生素的大肠杆菌中，核苷酸生物合成基因的缺失对环丙沙星杀伤敏感。同样，在金黄色葡萄球菌中，嘌呤营养缺陷型对利福平的持久性存在缺陷。预测这种相互作用背后的机制与嘌呤激活导致抗菌耐受性的严紧反应有关。因此，嘌呤生物合成抑制剂可能在治疗慢性感染中作为抗持久性或抗耐受性分子发挥作用。

除了耐受性外，抗生素耐药性已被证明可以改变代谢途径。在铜绿假单胞菌中，对哌拉西林具有抗性的进化后的种群经历了亮氨酸利用的损失，而妥布霉素抗性谱系使用N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为碳源改善了生长。通过分析代谢物丰度、基因表达和生长动力学的变化，已经证明对β-内酰胺类和氨基糖苷类具有进化抗性的菌株在代谢方面发生显着变化。值得注意的是，类似的策略已应用于抗寄生虫氏鼠疟原虫中。对药物乙胺嘧啶有抗药性的寄生虫比对药物敏感的寄生虫需要更多的PABA。Wale等人通过限制PABA阻止了小鼠感染期间乙胺嘧啶耐药性的产生。

7. 总结

营养物质的获取和生物合成对细菌的致病机制至关重要，抑制这些过程作为一种新抗生素的新方法具有很高的潜力。TnSeq研究表明，破坏营养生物合成与毒力之间存在明显联系，这种联系既是致病菌特异性的，又依赖感染部位。在感染过程中被仔细验证为必需的营养生物合成基因应优先作为新抗生素的靶标。靶向营养应激途径已成功使用了广泛的抑制剂，其中一部分在动物感染模型中显示出疗效。此外，磺胺类药物开创了细菌营养生物合成抑制剂临床成功的先例。自发现磺胺类药物以来，已经过去了将近100年，而且还没有新的营养物生物合成抑制剂进入临床开发阶段。事实上，由于缺乏有前途的抑制剂，过去和传统上都将重点放在富含营养的培养基上以进行抗菌发现和敏感性测试。尽管如此，营养物生物合成抑制剂作为单一疗法或与现有抗生素联合使用仍有希望。确保药物靶标与人体感染条件相关对于成功开发针对营养生物合成的抗生素至关重要。抗生素药物发现的创新将在寻找避免后抗生素时代的解决方案方面发挥重要作用，因此需要更多的研究来实施针对营养生物合成的药物发现和开发策略。

皆需解决的问题有：

（1）人类和动物感染模型之间的营养环境有何不同？由于这些差异，哪些营养生物合成途径被忽视为抗菌目标？

（2）营养生物合成抑制剂临床开发的技术和监管障碍是什么？抑制剂的成功需要对诊断和临床微生物学实践做出哪些改变？

（3）个体之间的营养可用性是否存在异质性，这是开发营养生物合成抑制剂的责任吗？

（4）耐药性对细菌代谢有何影响？我们如何利用抗生素耐药致病菌中细菌代谢的变化？

原文：Carfrae LA, Brown ED. Nutrient stress is a target for new antibiotics [published online ahead of print, 2023 Jan 27]. Trends Microbiol. 2023;S0966-842X(23)00016-1. doi:10.1016/j.tim.2023.01.002