用于慢性创伤光驱动治疗的多靶向纳米缀合物

摘要：致病细菌引起的糖尿病溃疡成为一种危及生命的多种疾病，由于愈合不良，仍然是一个关键的临床挑战。为了克服这一障碍，我们开发了一种基于三维多靶向纳米结构的非抗生素策略，该纳米结构具有近红外激光诱导的光热疗法，以促进由铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染的糖尿病伤口的愈合。该纳米缀合物是通过整合修饰细菌亲和分子苯基硼酸的金纳米棒和pH诱导的电荷可转换叔胺基团而制备的。除了与来自苯基硼酸基序的细菌细胞壁结合之外，纳米缀合物在细菌感染位点的酸性微环境中从负电荷到正电荷的专用电荷转换进一步为带负电的细菌提供了强大的靶向性。这种纳米缀合物可以通过光热消融靶向并杀死特定的细菌细胞。近红外光激发后，金纳米棒通过非放射性衰变途径释放能量，局部产生热量，有效杀死靶向细菌细胞，最终通过下调促炎因子的表达加速糖尿病大鼠的伤口愈合。总之，这种具有光热特性的纳米结构进化靶向策略有望成为修复多种细菌感染的糖尿病溃疡慢性伤口的其他治疗方案。

图1纳米缀合物的制备原理

图中为纳米缀合物的制备原理，图中可以看出，鉴于甲基丙烯酸2-（六亚甲基亚氨基）乙酯（pH 6.9）的pKa值和苯硼酸与细菌细胞膜上含糖类二醇的结合能力，使用通过可逆加成-断裂链转移聚合制备的嵌段共聚物（pHMEMA-b-pMAPBA）修饰金纳米棒，这赋予了纳米缀合物捕获细菌和微环境反应的能力。

图2金纳米棒的表征

图A为金纳米棒的TEM图像，图中可以看出，AuNRs约100 nm左右，随着pMAPBA的添加，纳米缀合物在中性条件下显示出更多的表面负电荷，表明带负电荷的pMABPA可以通过Au（I）–S键有效地涂覆AuNRs表面。同时，由于与带负电的有机或细菌细胞膜的亲和力较差，带大量负电荷的纳米缀合物有利于获得长循环时间。为了详细说明纳米缀合物的酸性敏感性，图B为DLS在不同pH溶液（pH 7.4或pH 6.0）中检测了zeta电位。在酸性条件下（pH 6.0），颗粒的zeta电位从负电荷转变为正电荷。这归因于pHMEMA从负电荷到正电荷的电荷转换，伴随着pH 6.0时的疏水性到亲水性转变，这表明纳米缀合物可以响应细菌感染位点的酸性微环境。考虑到金纳米棒作为各向异性金属纳米粒子表现出强烈的等离子体性质，图C进一步监测了纳米缀合物（AuNRs@PHM）在NIR激光（808 nm，2 W cm⁻²）照射下颗粒的温度表现出与时间和浓度的依赖性。在1000 μg/mL的高浓度下辐照6分钟，温度达到67.7 °C。即使浓度低至125 μg/mL，经过6分钟照射的NIR也会导致温度从11.8 ℃升高至42.5 ℃，这表明纳米缀合物（AuNRs@PHM）具有高光热转换效率。由于低细胞毒性是生物材料应用的先决条件，将纳米缀合物与NIH3T3细胞孵育，以通过CCK-8测定确定细胞毒性。图D中的结果表明，即使在1000 μg/mL的高浓度下，纳米缀合物的细胞活力也超过80%。可以看出，金纳米棒和纳米缀合物（AuNRs@PHM）（p＜0.01）。纳米缀合物的低细胞毒性表明，pHMEMA-b-pMAPBA的存在有效地改善了金纳米棒的细胞相容性。

图3 细菌对纳米缀合物的粘附

如图A和B所示，在中性条件下（pH 7.4），纳米缀合物对铜绿假单胞菌的粘附能力明显增加。这归因于苯硼酸与细菌表面的糖类二醇结合。当AuNRs@PHM达到500 μg/mL时，细菌的黏附率可达到83.5%。当纳米缀合物在酸性条件（pH 6.0）下与细菌孵育时，pHMEMA质子化，并发生构象变化，成为其活性形式，能够粘附带负电的细菌最终有助于增强细菌聚集。在酸性条件下AuNRs@PHM30, AuNRs@PHM40和AuNRs@PHM50的细菌黏附率分别为76.6%、80.5%和83.5%。研究发现，在pH为6.0时，它们之间的结合能力几乎没有差异，不同的结合能力主要是由于pMABPA的含量。鉴于纳米缀合物对铜绿假单胞菌表现出优异的结合亲和力，纳米缀合体对金黄色葡萄球菌的结合能力也以相同的方式测量。图C和D中的结果表明当纳米缀合物的浓度为500 μg/mL时，pH 6.0时的粘附效率约为83.5%，pH 7.4时的粘附率约为81%。总之，纳米缀合物具有广谱细菌粘附性，预示着在细菌检测领域具有非凡的潜力。

图4 光热杀菌试验

如图所示，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌经纳米缀合物 在808 nm激光照射下。结果表明纳米缀合物导致局部过热，并通过细菌细胞膜破裂导致细菌死亡。图A-C分别为AuNRs@PHM30、 AuNRs@PHM40和AuNRs@PHM50在NIR激光照射下，在LB琼脂平板上生长的铜绿假单胞菌菌落照片；图E-F为AuNRs@PHM30、 AuNRs@PHM40和AuNRs@PHM50在NIR激光照射下， LB琼脂平板上生长的金黄色葡萄球菌菌落照片，在三种类型的纳米缀合物中，AuNRs@PHM50在黑暗和激光照射下都保持了良好的抗菌活性，并显示出完全的细菌清除。增强的pMABPA含量提高了光热转化效率，从而消除了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，这是由于其优异的细菌粘附能力。

为了进一步评估AuNRs@PHM针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，活细菌用吖啶橙（AO）染色，显示绿色荧光，而死细菌用溴化乙锭（EB）染色，呈现红色荧光。图中为使用CLSM对细菌的荧光照片进行成像。与PBS共培养后，观察到强烈的绿色荧光，表明保留了大量的活细菌。相反，在NIR照射4分钟后AuNRs@PHM50聚集成巨大的团并显示红色荧光，表明细菌被杀死。有效的杀菌效果来自于通过NIR引起的局部过热而导致的有效细菌和细胞膜破裂。AuNRs@PHM50作为有效地将激光能量转换为热能的优异光热材料，这归因于近红外区域中AuNRs的强局域表面等离子体共振。

图5生物膜抑制试验

考虑到生物膜在微生物生长、对宿主细胞的粘附和耐药性中发挥重要作用，图A示意性地说明了这些纳米缀合物根据生物膜形成的抑制的代表性应用。图B表示在不同浓度的纳米缀合物下测定生物膜形成的抑制。与铜绿假单胞菌共培养后，AuNRs@PHM30, AuNRs@PHM40和AuNRs@PHM50浓度达到62.5μg/mL时，生物膜的抑制率达到50% 。鉴于AuNRs@PHM50在250 μg/mL浓度下，表现出较好的抑制能力，生物膜抑制率达到83.5%。图C表明金黄色葡萄球菌的抑制生物膜形成结果与铜绿假单胞菌一致。

图6体内研究

图A显示为为了评估纳米缀合物，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合细菌悬浮液来影响大鼠的伤口的治疗效果的实验示意图。图C为用PBS（I组）、NIR照射（PBS+NIR，II组），（AuNRs@PHM50（III组），以及AuNRs@PHM50近红外辐射(AuNRs@PHM50+NIR，IV组）的第IV组分，其中图B为在第1天、第4天、第8天和第12天中四组处理的伤口。图C中可以看出，纳米缀合物在808 nm激光照射下，记录了伤口周围的局部温度，并立即升高了61 °C，证明了体内也保存了用于消除细菌的光热特性。图D显示为用AuNRs@PHM50在NIR照射下，特别是在第8天和第12天，纳米缀合物变得比其他三组小，这表明纳米缀合可以促进伤口愈合。将感染伤口组织中获得的细菌接种在LB琼脂平板上，并使用标准平板计数方法计算细菌数量。处理组中CFU的数量AuNRs@PHM50在NIR照射下明显低于其他三组。此外，图E为测量伤口面积以分析四种不同治疗的治疗效果。同样AuNRs@PHM50+NIR组显示出较小的伤口面积，在治疗12天后显示出完全的伤口愈合。

考虑到再上皮化是伤口愈合过程中的一个重要指标，对创伤后12天的皮肤切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，以了解不同治疗后的伤口愈合过程。如图A所示，与其他组不同，IV组分伤口间隙中观察到肉芽组织的形成、上皮化和下层伤口结缔组织的收缩。当活体受到热刺激时，会诱导热休克反应，同时，一个名为热休克蛋白（HSPs）的蛋白质家族，在应激状态下充当细胞的分子伴侣，并表现出细胞保护特性。免疫组化染色表明IV组分的HSP70表达与其它三个组分明显增强，这表明AuNRs@PHM50可以刺激HSP70的编码，保护正常组织免受热损伤。此外，为了评估宿主的炎症反应，本研究分析了创伤愈合过程中作为一种重要炎症指标表达的产物TNF-α。808 nm近红外辐射照射AuNRs@PHM50时，与其他三组相比， TNF-α的表达水平较低，与健康伤口组织相似。如图B–D所示，表明在用AuNRs@PHM50在NIR照射12天后，与其它组分相比，含有促炎细胞因子的IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低。因此，纳米缀合物为治疗受损的糖尿病伤口提供了一种有吸引力的策略。

结论

1、本研究构建了一种多靶向纳米缀合物，它可以对细菌感染的酸性微环境做出反应并粘附于细菌，从而有效地消除革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌（接近100%），而不会引发耐药性。

2、通过将对细菌的结合亲和力与纳米缀合物的光热性质相结合，获得了协同杀菌效果，尤其是在含有更多结合配体的纳米缀合体中。

3、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染微环境的pH值可以激活功能化的金纳米棒，从而发挥更强大的杀菌和抑菌能力。

4、本研究将糖分子（如葡萄糖和半乳糖）添加到纳米缀合物悬浮液中，这有助于硼酯键的形成，以提高AuNRs@PHM稳定性。

5、AuNRs@PHM可以根据上述策略进行改进。鉴于具有光热效应的纳米缀合物可以充分消除细菌以促进伤口愈合，本研究为结合光热功能的多靶向纳米缀合体的设计以及为慢性传染病的管理提供新的见解。

参考文献：

Niu, Y., Zhang, J., Sun, J., et al. (2021). A multi-targeted nanoconjugate for light-driven therapy of chronic wounds. Chemical Engineering Journal, 414, 128835.