【论文解读】广东省科学院微生物研究所吴清平院士团队在探究冻干保护剂的机制新发现：L-谷氨酸钠高冻干存活率的秘密

制备菌粉的技术有多种，包括喷雾干燥、真空冷冻干燥和流化床干燥。目前，已经开发了许多方法来提高菌株冻干后的存活率。2024年4月23日，广东省科学院微生物研究所吴清平院士团队在SCI期刊《Food Bioscience》在线发表了一篇题为《Sodium L-glutamate improves the lyophilization survival rate of Lactiplantibacillus plantarum L5 by regulating cellular pyruvate》的研究性论文。吴清平院士为该论文的通讯作者，微生物安全与健康研究发展中心周润硕士研究生和广东科环生物科技有限公司吴毓薇为共同第一作者。该研究得到国家重点研发计划（2022YFD2100700）、广东省重点领域研发专项（2022B1111070006）和广东省科学院（2021GDASYL-20210103012）的支持。

研究简介：

本研究筛选出植物乳杆菌L-5的最佳冻干保护剂-L-谷氨酸钠，成活率超过90%。4℃保存6个月后，活菌数稳定在4.80×1011CFU/g，并且菌株的益生特性与冻干前相似。最后，通过转录组分析发现细胞中的丙酮酸含量较高。

研究背景：

大量研究表明，菌粉冻干过程中使用的保护剂会影响产品冻干后的回收率以及储存过程中菌株细胞的活力，最终影响益生菌的功能性的发挥。此前的研究报道，良好的保护剂可以维持细胞膜的渗透屏障和结构完整性，防止细胞内容物在冻干过程中渗漏。

在吴清平院士团队之前的研究中，我们探索了一株益生菌-植物乳杆菌L-5，它对改善睡眠质量具有积极作用，在培养液中产生的GABA含量为262mg/L。此外，该菌株的施用已被证明可以显着降低特发性震颤个体震颤的严重程度并改善运动和抓握能力。因此，本研究的目的是筛选最佳保护剂以提高长储存时间的植物乳杆菌L5的冻干存活率，并探索植物乳杆菌L5冻干最佳保护剂的潜在机制。

研究方法：冻干后表型测定与转录组分析

为了筛选出植物乳杆菌L-5的最佳冻干保护剂及探究其保护机制，研究团队采取了冻干后表型测定与转录组分析的研究方法：

1. 冻干后表型测定：  

  首先是从储存时间和温度对冻干粉存活率对已有常见的冻干保护剂进行筛选，之后比较冻干前后益生特性的变化以及微观结构。

2. 转录组分析：  

  为了探究出最佳冻干保护剂的保护机制，文章评估了该菌株冻干前后转录水平的变化。 并分析揭示了该菌株在冷冻和真空胁迫下诱导的几种反应途径，包括常见的ABC转运蛋白、丙酮酸生物合成和代谢途径以及嘌呤生物合成途径。

研究发现：

1、L-谷氨酸钠是最佳冻干保护剂且能稳定菌株的细胞结构稳定与益生特性

储存时间和温度对植物乳杆菌L5粉末冻干的影响如图1所示。在L-谷氨酸钠的保护下，冻干后的活菌数为6.43×1011CFU/g。保存1个月后，在4°C、−20°C和25°C温度下，活菌数量显着下降（p值<0.05），计数分别为4.83×1011CFU/g、5.22×1011 CFU/g和5.7×1010CFU/g。随着保存时间的延长，活菌数没有明显变化。

图1

当益生菌在加工、储存和胃肠道消化过程中暴露于恶劣环境时，其活力常常受到影响。 耐受胃酸、产酸和自凝集的能力对于评估益生菌的功能至关重要。本研究研究中测试了益生菌特性，发现冻干对植物乳杆菌L5的益生菌特性有一定影响，如图2所示，L-谷氨酸钠组的表现优于PBS对照组，L-谷氨酸钠作为氨基酸保护剂，可以渗透到细胞内部。保护剂的氨基与微生物蛋白质的羧基发生反应，可以在冻干过程中稳定蛋白质结构，保持益生菌蛋白质的功能，并保留大量残留水分，减少冻干过程中过多的水分流失。

图2

冻干过程中，结合水的损失是损害细胞壁稳定性的关键因素。细胞中游离水的存在会导致冰晶的形成，对细胞壁和细胞膜造成机械和溶质损伤。这在PBS组中表现得很明显，可以看到细菌细胞壁出现裂纹，并且细菌有明显的皱缩（图3B和E）。 但在L-谷氨酸钠的保护下，冻干菌粉保持了较为完整的形态，没有明显的损伤，表明L-谷氨酸钠可以稳定细胞结构。图4发现L-谷氨酸钠对细胞壁的肽聚糖结构具有稳定作用。

图3

图4

2、L-谷氨酸钠通过调节细胞丙酮酸来提高冻干存活率

丙酮酸已被发现以多种方式积累，被认为是葡萄糖氧化或无氧代谢的关键中间体，也是活性氧（ROS）的有效清除剂。本研究的结果进一步证实了丙酮酸在植物乳杆菌 L5 转录组水平上响应真空和冷胁迫的重要作用。图5可以观察到冻干后丙酮酸积累，丙酮酸脱氢酶基因pdhA和丙酮酸氧化酶基因pox5_5的表达显着下调，降低了菌株对氧化应激的敏感性。并且在真空和冷胁迫下，冻干植物乳杆菌L5中丙酮酸积累、生物合成和支链氨基酸（包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸）的代谢下调同时发生。支链氨基酸是必需氨基酸，在代谢稳态中发挥关键作用。调节细胞内支链氨基酸的低代谢并增强其循环可能是植物乳杆菌L5高存活率的原因。

图5

总体而言，本研究侧重于转录组分析，以了解 L-谷氨酸钠在冻干过程中对植物乳杆菌的保护机制。对代谢途径的分析揭示了L-谷氨酸钠保护作用的潜在关键机制，它提高了微生物对真空和冷应激的响应能力，例如ABC转运蛋白、丙酮酸生物合成和代谢以及嘌呤的调节代谢。此外，丙酮酸在微生物细胞中的积累也被发现是一个关键因素。此研究结果为进一步研究菌株的冻干机制提供了有价值的见解，并为生产和保存冻干菌粉提供了潜在的策略。

参考文献链接： https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.104189

作者简介：

通讯作者

吴清平，男，中国工程院院士，博士，研究员，博士生导师，微生物安全与健康专家。现任广东省科学院微生物研究所名誉所长、广东省科学技术协会副主席，并兼任中国食品科学技术学会副理事长、中国食用菌协会名誉会长、国家微生物种业产业技术创新战略联盟理事长。吴清平院士长期致力于中国微生物安全与健康菌种、基因与组学大数据库构建和应用研究，近年来针对我国食品行业出现严重的微生物安全风险，从基础研究着手，发明先进的共性监控技术并建立起相关理论体系，研制出重点产业食品安全控制技术和与国际接轨的先进标准，解决了食品安全中的重要科学问题和关键技术难题，显著推动我国食品安全科学理论不断提升和产业健康发展。