基于活性乳酸菌株的吸入式治疗产品，可改善肺结构和功能、减少中性粒细胞浸润以及降炎

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来源：iSynFox

2024-10-08 10:58:28

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核心提示：基于活性乳酸菌株的吸入式治疗产品，可改善肺结构和功能、减少中性粒细胞浸润以及降炎。

文献信息：

作者：Teodora Nicola, Nancy Wenger, Xin Xu, Michael Evans, Luhua Qiao, Gabriel Rezonzew, Youfeng Yang, Tamas Jilling, Camilla Margaroli, Kristopher Genschmer, Kent Willis, Namasivayam Ambalavanan, J. Edwin Blalock, Amit Gaggar, Charitharth Vivek Lal

接收时间：31 July 2024

https://doi.org/10.1038/s41467-024

Nature Communications 影响因子：16.6

背景介绍

支气管肺发育不良（BPD）是影响早产儿的一种慢性肺部疾病，其特征为肺组织炎症和肺泡及血管发育失调。婴儿期接触高氧环境、机械通气导致的容积伤以及感染等不良因素，可能会对患儿的肺部健康造成长期影响，增加他们成年后发展成慢性阻塞性肺病（COPD）等呼吸系统疾病的风险。

BPD和COPD这两种疾病均表现为肺组织退化、中性粒细胞浸润以及肺功能降低。此外，它们都伴随着肺部微生物组分的变化，特别是硬壁菌门细菌的减少。尽管如此，肺部细菌与疾病发展具体机制之间的联系尚未完全明确。

近期研究提出了一个假设，即BPD小鼠模型中乙酰化脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ac-PGP）信号通路和中性粒细胞活性可能增强。通过功能性增强和减弱实验，研究人员发现Ac-PGP在BPD的发展中扮演着关键角色。因此，研究测试了一种基于活性乳酸菌株的吸入式活体生物治疗产品（LBP），在BPD和COPD的体外和体内模型中，这种基于乳酸菌的LBP显示出改善肺结构和功能、减少中性粒细胞浸润以及降低多种促炎标志物的效果。

图文解读

图1| 严重的 BPD 以乳酸菌减少、变形菌增加和

通过 MMP-9/Ac-PGP 途径介导的中性粒细胞浸润为特征

A 与对照组相比，严重 BPD 婴儿的变形菌增加，硬壁菌减少，并且通过 16s 微生物组测序测量的内毒素水平升高（P = 0.0284）（数据来自参考文献 12）。严重 BPD 婴儿的 B Ac-PGP（P = 0.0003）、C MMP-9（P = 0.0002）、D MPO（P = 0.0023；对照组 N = 10，BPD N = 7 样本）和 E NE 蛋白（P < 0.0001；对照组 N = 16，BPD N = 8 样本）在他们的气管抽吸物中的浓度更高。未配对 t 检验。Ac-PGP 通过串联质谱测量；MMP-9、MPO 和 NE 通过 ELISA 测量。对照组 N = 7，BPD N = 7 样本。小鼠从 PN3 到 PN14 暴露于高氧（HO），在 PN3、6、9 和 12 上给予 LPS，并在 PN14 处死。

F 暴露于 HO + LPS 的小鼠表现出严重的肺泡发育不良和简化。收获的肺组织切片在苏木精和伊红（H&E）染色后以 4 倍放大拍摄。

G LPS 小鼠的放射肺泡计数（RAC）减少。N = 24 样本。肺功能恶化，通过 H 气道阻力（增加）（空气 N = 7，空气+LPS N = 8，HO N = 5，HO + LPS N = 7 小鼠）和 I 顺应性（减少）在 HO + LPS 小鼠中测量（空气 N = 10，空气+LPS N = 8，HO N = 5，HO + LPS N = 7 小鼠）。暴露于 LPS 的小鼠在支气管肺泡灌洗液（BAL）中 J Ac-PGP（空气 N = 8，其他组 N = 7 小鼠）和 K MPO 的浓度更高（空气 N = 10，空气 + LPS N = 7，HO N = 6，HO + LPS N = 5 小鼠）。单向 ANOVA，Tukey 的多重比较测试。条代表中位数 ± 四分位数范围。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

表1 | 三种喷雾干燥粉末配方的气溶胶和物理特性

- MMAD：中值质量空气动力学直径（Median Mass Aerodynamic Diameter）

- GSD：几何尺寸分布（Geometric Size Distribution）

- FPF：细颗粒分数（Fine Particle Fraction）

- gPSD：几何颗粒尺寸（Geometric Particle Size）

- DSC：差示扫描量热法（Differential Scanning Colorimetry）

- Tg：玻璃化转变温度（Glass Transition Temperature）

- KF：卡尔费休法（Karl Fischer）

- CFU：菌落形成单位（Colony Forming Units）

图2| Ac-PGP 驱动组织损伤，乳酸菌 LBP 减少中性粒细胞炎症

Ac-PGP 和 LPS 与高氧 (HO) 结合暴露各自导致了严重的肺泡发育不良和简化。

A 使用 RTR (精氨酸-苏氨酸-精氨酸) 治疗改善了肺泡结构。H&E 染色，4倍放大。

B 给予 Ac-PGP 或 LPS 后 RAC 减少（N = 120 样本），C 在 HO 中 Ac-PGP 暴露使 MPO 表达增加（P = 0.0451；空气 N = 11, 空气 + Ac-PGP N = 8, HO N = 8, HO+Ac-PGP N = 5 小鼠）。

D 在 Ac-PGP + HO 小鼠中右心室肥大 (RVH) 增加（P = 0.028；N = 4 小鼠）。

E 给予 RTR 治疗后 RAC 改善。N = 120 样本。

F 在 LPS + HO 暴露后 MPO 表达增加，RTR 治疗后减少（P = 0.0079；空气 N = 10, 空气 + RTR N = 9, HO N = 5, HO + LPS + RTR N = 5 小鼠）。

G 在 LPS + HO 小鼠中使用 RTR 治疗后 RVH 减少（P = 0.0187；N = 4 小鼠）。Mann–Whitney U 检验，Kruskal–Wallis, Dunn’s 多重比较测试。

H 高氧加剧了经鼻内暴露于大肠杆菌的小鼠肺泡简化，而经气管 LBP 治疗改善了 E. coli + HO 小鼠的组织结构。H&E 染色，4倍放大。

I 在 HO + E. coli 暴露后 RAC 减少，LBP 治疗后恢复正常。空气 N = 7, 空气 + E. coli N = 5, 空气 + E. coli + Lacto N = 5, HO 组 N = 5 小鼠各。

J BAL 中 MMP-9, K NE, L MPO, M IL-6, 和 N CRP 在 LBP 治疗后减少。单向 ANOVA, Tukey’s 多重比较测试。空气 N = 7, 空气 + E. coliN = 10, 空气 + E. coli + Lacto N = 5, HO N = 6, HO + E. coli N = 8, HO + E. coli + Lacto N = 5 小鼠。条代表中位数 ± 四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

图3| 乳酸菌混合物通过 L (+) 乳酸产生减少中性粒细胞炎症

A 单独的菌株 L. plantarum (P)、L. acidophilus (A) 和 L. rhamnosus (R) 比单独的 L. casei、L. paracasei、L. reuteri 和 L. fermentum 菌株以及没有乳酸菌处理的仅 E. coli 暴露相比，更能减少 MMP-9 表达。N = 7。

B 不同比例的混合 P、A 和 R 在不同程度上减少 MMP-9。N = 7 孔。

C 在减少有毒刺激暴露的体外人支气管上皮 (HBE) 模型中，P、A 和 R 的混合物比单独的菌株更有效地减少 MMP-9。N = 4 孔。

D 乳酸菌混合物培养上清液在增加的浓度下减少 MMP-9 表达。N = 6。

E 单独的活性乳酸菌菌株与其他三种混合物菌株的上清液共转染。L. acidophilus 上清液与活的 A、P、R 和 PR 混合物培养，增加了 P 和 PR 混合物的乳酸基因表达（作为代表性示例显示）。AS A N = 13, AS P N = 6, AS R N = 9, AS PR N = 9 孔。

F 乳酸菌菌株单独和作为混合物产生更多的 L (+) 乳酸而不是 D (+) 乳酸。N = 6 孔。

G L (+) 乳酸减少暴露于 E. coli 的 HBE 细胞中的 MMP-9 表达 (N = 6 孔)，而 H D (−) 乳酸则不减少 (N = 4 孔)。

Kruskal–Wallis 检验，Dunn’s 多重比较。细胞培养进行三次重复。条代表中位数 ± 四分位数范围。

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

图4| L (+) 乳酸减少 MMP-9 并在体内由乳酸菌产生

通过气管内给药的方式，将 L (+) 乳酸给予经 LPS 处理 10 天的小鼠。

A 肺组织学图像显示 LPS 损伤后的肺泡简化，以及 LA 治疗后的轻微恢复。H&E 染色，4倍放大。

B 给予每只小鼠 1 ug/g 体重的 L (+) LA 治疗后，MLI 减少（P = 0.0152；N = 6 小鼠）。

C 通过气管内给予 L (+) 乳酸治疗后，肺组织 MMP-9 表达减少（对照 N = 10, LPS N = 8, LA 0.125 N = 4, LA 0.5 N = 12, LA 1.0 N = 4 小鼠）。

D 健康小鼠经气管接种乳酸菌 LBP 后 3 小时，乳酸菌（绿色）定位到肺上皮。DAPI 蓝色。4倍放大，插图为 40倍放大。N = 5。

E 健康小鼠经气管接种 LBP 至肺部，通过减少菌落数显示细菌的逐渐清除超过 72 小时。

F 健康小鼠经气管接种 LBP 至肺部，显示 L (+) 乳酸产生增加，并通过 72 小时后剂量持续效果。L(+) LA 通过乳酸比色法测量。每个时间点 N = 3 小鼠。

G–I 炎症生物标志物 MMP-9、CRP 和 IL-6 在 LBP 剂量后 4–8 小时升高，并在 16–24 小时恢复到基线水平。每个时间点 N = 5 小鼠。

Mann–Whitney U 检验和 Kruskal–Wallis, Dunn’s 多重比较。条代表中位数 ± 四分位数范围。

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

图5| 喷雾干燥产生含有活性细菌的小流动性粉末颗粒

A 用于将乳酸菌干燥成小流动性粉末颗粒的喷雾干燥过程的示意图。

B 干燥后三种配方粉末颗粒的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。从每个样品中获取了 25,000、50,000 和 100,000 倍放大的图像（从左到右）。

图6| 基于乳酸菌的活体生物治疗产品 (LBP) 改善慢性阻塞性肺病 (COPD) 小鼠模型中的炎症生物标志物及肺结构和功能

小鼠暴露于香烟烟雾中1个月，并经气管内给予乳酸菌 LBP (Lacto) 治疗。

A 肺组织学图像（H&E 染色，40倍放大）通过 (B) 平均线性截距 (MLI) 测量，显示1个月烟雾暴露后肺泡结构没有显著恶化。测量值：空气 N = 5, 空气 + Lacto N = 11, 烟雾 N = 23, 烟雾 + Lacto N = 27 样本。暴露于烟雾并接受 Lacto 治疗的小鼠在 (C) 肺组织 MMP-9 表达 (空气 N = 4, 烟雾 N = 5 小鼠)，D 血清 MMP-9 蛋白水平 (空气 N = 4, 烟雾 N = 5 小鼠)，以及 E 支气管肺泡灌洗液 (BAL) IgA 蛋白水平 (空气 N = 4, 烟雾 N = 6 小鼠) 方面显示出改善。小鼠暴露于经气管内给予的猪胰弹性蛋白酶 (PPE) 和 LPS，导致显著的肺泡发育不良和简化。

F 肺组织学图像（H&E 染色，4倍放大）显示，在损伤期间吸入 Lacto LBP 减少了组织损伤。

G 在 PPE 和 PPE + LPS 暴露组中，给予 Lacto LBP 治疗后 MLI 得到改善。

H 肺功能通过增加的阻力测量，在暴露于 PPE 后恶化，在接受 Lacto LBP 治疗后改善。

I 通过顺应性测量的肺功能在各组之间没有显著变化。

J 肺组织中 MMP-9 表达在 PPE + LPS 暴露后增加，在接受 Lacto LBP 治疗后减少。

K 在 PPE 和 PPE + LPS 暴露后 BAL 中的 MMP-9 蛋白增加，在接受 PPE + LPS 小鼠的 Lacto LBP 治疗后减少。

L 在 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治疗后 BAL 中的 NE 蛋白减少。

M 在 PPE + LPS 暴露后 BAL 中的 CRP 蛋白增加，在接受 Lacto LBP 治疗后减少。

N 在 PPE 和 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治疗后 BAL 中的 IL-8 蛋白减少。

O 在对照、PPE 和 PPE + LPS 小鼠中，Lacto LBP 治疗后 BAL 中的 IgA 蛋白增加（改善）。N = 12 小鼠（6 雄/6 雌）。

Kruskal–Wallis 检验，Dunn’s 多重比较。条代表中位数 ± 四分位数范围。

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

图7| 小鼠通过气管内给予 PPE 和 LPS 来建立肺气肿和细菌驱动的炎症

A 肺组织学图像（H&E 染色，4倍放大）显示，在损伤建立后2周给予 Lacto LBP 治疗，减少了炎症并改善了组织结构。损伤后给予类固醇治疗减少了炎症。

B PPE 和 PPE + LPS 暴露均增加了平均肺泡大小，而 Lacto LBP 治疗显著减少了（改善了）它。类固醇氟替卡松（FF）也显著减少了 MLI，但在 PPE 组中不如 Lacto LBP 显著。测量值：辅料 N = 16, Lacto N = 8, 类固醇 N = 18, PPE + 辅料 N = 44, PPE + Lacto N = 18, PPE + 类固醇 N = 18, PPE + LPS N = 13, PPE + LPS + Lacto N = 24, PPE + LPS + 类固醇 N = 23 样本。

C 在减少暴露于 PPE + LPS 的小鼠 BAL 中的 MMP-9 蛋白方面，Lacto LBP 的效果优于类固醇。

D 在减少暴露于 PPE 和 PPE + LPS 的小鼠 BAL 中的 CRP 蛋白方面，Lacto LBP 的效果与类固醇相当。辅料 N = 5, Lacto N = 2, 类固醇 N = 3, PPE + 辅料 N = 3, PPE + Lacto N = 6, PPE + 类固醇 N = 4, PPE + LPS N = 5, PPE + LPS + Lacto N = 7, PPE + LPS + 类固醇 N = 6 小鼠。Kruskal–Wallis 检验，Dunn’s 多重比较。条代表中位数 ± 四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

图8| 吸入式基于乳酸菌的活体生物治疗产品 (LBP) 在 PPE 小鼠模型中显示出良好的安全性和生物分布特性

A 在生物分布研究中，所有小鼠在第 23 天（终点牺牲）和第 28 天（恢复牺牲）均存活。为了可见性，生存曲线进行了偏移。

在 B–H 终点牺牲小鼠和 I–O 恢复牺牲小鼠中，体重、体温、血氧饱和度、呼吸频率、呼吸膨胀、心率和脉搏膨胀在 LBP 给药 2 周后仍保持在正常范围内。

P 来自 PCR 的代表性凝胶显示终点牺牲组织肺、血清和大脑中没有 LBP 乳酸菌株的存在。

Q 来自 PCR 的代表性凝胶显示恢复牺牲组织肺、血清和大脑中没有 LBP 乳酸菌株的存在。PBS 和 PPE 对照每组 N = 10；PPE + 安慰剂，LBP 1 mg，LBP 3 mg 每组 N = 15 小鼠。Kruskal–Wallis 检验，Dunn’s 多重比较。条代表中位数 ± 四分位数范围。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。