克服大肠杆菌中异源蛋白低表达或无表达挑战的策略

Strategies to overcome the challenges of low or no expression of heterologous proteins in Escherichia  coli

克服大肠杆菌中异源蛋白低表达或无表达挑战的策略

期刊：Biotechnology Advances

IF:12.1

研究背景

自20世纪70年代以来，大肠杆菌已成为分子生物学和生物技术中重组蛋白表达的常用宿主。它具有生长迅速、培养条件简单以及拥有丰富的分子工具等优势，目前已有超过100种在大肠杆菌中表达的蛋白产品实现了商业应用。重组蛋白在大肠杆菌中的表达涉及宿主选择、基因克隆、载体构建、表达条件优化和表达结果验证等多个环节。

在大肠杆菌中构建重组表达系统时，常面临目标蛋白产量低或无的挑战。多项研究表明，异源重组蛋白在大肠杆菌中不表达是一个普遍且显著的现象。例如，Northeast Structural Genomics平台的相关研究显示，大量克隆的蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平极低甚至为0。

研究内容

本文综述了重组蛋白在大肠杆菌中不表达的最新研究进展，并讨论了重组蛋白在大肠杆菌中不表达的潜在原因。鉴于T7表达系统在学术界的重要作用（图1），大量的蛋白质表达研究都是基于该系统进行的。因此，在本文中主要分析基于T7表达系统的蛋白不表达的影响因素。

图1.大肠杆菌BL21(DE3)-T7表达系统。在该系统中，靶基因的表达由iptg诱导的载体上的T7启动子调控。大肠杆菌BL21（DE3）的基因组已被改造成含有T7 RNA聚合酶基因，该基因可识别T7启动子。该基因受IPTG诱导的PlacUV5启动子调控。在培养基中添加IPTG触发lacUV5启动子的激活，导致特异性T7 RNA聚合酶的合成。随后，T7 RNA聚合酶在IPTG的作用下识别并激活位于重组质粒上的T7启动子，启动目标基因的高效转录。产生的mRNA被宿主细胞的核糖体翻译以产生所需的重组蛋白。

1.蛋白毒性对表达的影响及解决策略

毒性蛋白类型及影响：常见的有毒蛋白包括如RegB等核糖核酸酶、人雌激素受体α、DNA结合蛋白CENP-B等。这些蛋白在不同生长阶段对宿主细胞产生毒性，可能导致生长抑制甚至细胞死亡。有些蛋白在诱导前的生长阶段就表现出毒性，而有些则在诱导后（过表达时）才表现出毒性，如一些膜蛋白。

解决策略：针对蛋白毒性，可采用多种策略。例如，使用具有T7 RNAP抑制剂的菌株（如BL21(DE3)pLysS和pLysE），可降低T7启动子在诱导前的转录强度，从而减少毒性。阿拉伯糖诱导型启动子pBAD因具有低基础表达和严格的阿拉伯糖控制特点，也常用于有毒蛋白的表达。此外，开发能耐受有毒蛋白的新型宿主菌株，以及调节蛋白表达速率也是可行的方法。还可以通过将有毒蛋白分泌到细胞外的方式来避免对细胞内生长的损害，这需要在目标蛋白的N - 末端融合信号肽，大肠杆菌有多种可用的信号肽，如OmpA、OmpF、PelB等，并且其分泌途径包括Sec依赖途径、SRP途径和TAT途径等（图2）。

图2 大肠杆菌II型分泌途径。(a) sec依赖途径适用于细胞质内未展开的蛋白质。代表性的信号肽包括pelB、OmpA和PhoA。分泌的蛋白质会在质周间隙中折叠。(b)信号识别颗粒（SRP）途径可以分泌已经在细胞质内折叠的蛋白质。与sec依赖通路一样，它基于SecYEG孔。(c)双精氨酸易位TAT途径利用含有双精氨酸的特异性信号肽，不依赖于SecYEG孔，也能够分泌折叠蛋白。

2.基因序列对蛋白表达的影响及机制

密码子偏好的影响：遗传密码中多数氨基酸由多个密码子编码，而不同生物的tRNA种类和数量不同，导致密码子偏好。在大肠杆菌中，密码子偏好是影响蛋白表达的关键因素之一。例如，一些稀有密码子如AGA、AGG、CGG（精氨酸）和AUA（异亮氨酸）等对重组蛋白表达有显著抑制作用。密码子的解码速率受多种复杂因素影响，包括tRNA的浓度、修饰和激活过程、扩散动力学以及密码子与反密码子的亲和力等，同时密码子上下游序列也会影响其解码速率。

mRNA结构是影响蛋白表达的另一个重要因素。其二级结构对翻译过程的多个阶段有影响，包括mRNA - 核糖体结合、翻译起始和肽链延伸。目前有多种mRNA结构预测和映射方法，如自由能最小化、次优结构预测、碱基配对概率预测、并行分析RNA结构（PARS）映射和化学修饰探测等（图3）。研究表明，mRNA结构与蛋白表达水平相关，如mRNA 5′端的折叠能与荧光蛋白的表达强度相关。

图3 mRNA结构预测和作图方法的比较综述。(a)自由能最小化涉及计算具有最低自由能的最热力学稳定的结构。(b)次优结构给出了一个预测数据集，从中可以搜索有代表性的结构。(c)碱基对概率预测计算一个RNA序列在所有可能的结构中形成碱基对的可能性。(d) RNA结构平行分析（PARS）采用酶探针通过差异切割单链和双链区域来确定RNA的结构，并通过PARS评分进行量化。化学修饰探测包括通过引物延伸（SHAPE）分析的选择性2 ' -羟基酰化，以评估RNA核苷酸的灵活性，通过差异反应性推断结构，并用于计算突变率。

3.多参数共同影响

重组蛋白的表达受上述因素的联合调控，包括密码子的使用和mRNA的结构。密码子使用的变化可以影响mRNA的结构，密码子使用与mRNA各位置结构的相互作用可以对蛋白质的表达产生实质性的影响。真核生物和原核生物的基因组分析表明，高表达基因通常在起始密码子下游含有一段30-50个密码子，这与较慢的翻译速率有关。

核糖体分析结果还表明，在翻译起始阶段，该区域的核糖体密集富集，称为“斜坡序列”（图4a）。密码子使用异常序列的意义是两个相互矛盾的假设的主题。“斜坡假说”表明，这些密码子的存在旨在减缓翻译延伸率，从而降低核糖体干扰mRNA的可能性，并防止核糖体脱落（图4b） 。相反，“结构假说”提出，这些密码子旨在减少mRNA在起始位点的结构折叠（图4c）。

图4.重要斜坡序列及其密码子异常用法的两个假设

除了翻译起始过程中斜坡序列的复杂影响外，密码子使用和mRNA结构之间的相互作用还通过改变细胞资源（如核糖体和翻译必需物质）的比例来影响蛋白质表达和宿主生长。可以考虑几种情况（图5)：当mRNA的5 '端结构最低或较弱且缺乏翻译放慢密码子时，游离核糖体可以快速结合和翻译，在保护mRNA不被降解的同时产生大量蛋白质（图5a）。相反，如果罕见的密码子翻译缓慢，则会导致核糖体停滞，减少蛋白质产生并增加核糖体占用（图5b）。当只有mRNA的5 '端高度结构化时，核糖体难以结合并启动翻译，导致蛋白质表达最少，而不会显著消耗营养物质或核糖体（图5c）。当5 '端和下游区域都具有高结构时，核糖体发现启动翻译具有挑战性，而下游结构保护mRNA免受降解。这种情况消耗了大量的“闲置”核糖体，但导致蛋白质产量最少，这对蛋白质表达和宿主生长都是有害的（图5d）。

图5.mRNA的结构和密码子的使用共同影响蛋白质的表达过程

研究结果

1.解决异源蛋白表达问题的综合优化方法

密码子使用的优化。早期采用密码子频率和CAI等参数进行优化，现考虑更多参数如tRNA适应指数（tAI）和标准化翻译效率（nTE）。常见的优化策略包括“使用最佳密码子（UBC）”、“匹配密码子使用（MCU）”和“协调相对密码子适应性（HRCA）”。工具如OPTIMIZER和DNA Chisel可用于优化，同时引入异源tRNAs也是一种解决策略。例如，Rosetta菌株系列和BL21 - CodonPlus菌株等通过携带特定tRNA基因提高了某些蛋白的表达水平。

融合标签的利用。在大肠杆菌表达系统中，融合标签/短肽是提高蛋白表达和解决不表达问题的有效策略。常用融合标签包括MBP、SUMO和TrxA等，它们可调整翻译起始区域附近的核苷酸序列，协助蛋白折叠，提高表达水平和溶解性。较小的融合肽（通常不超过15个氨基酸残基）也能通过改变蛋白净电荷、加速翻译或防止核糖体停滞等机制提高表达水平和溶解性。

基于大数据和深度学习的综合优化方法。由于影响因素复杂且机制理解不精确，传统的基于特定参数的密码子优化方法可能无效。新出现的工具和算法利用大规模数据和深度学习技术，综合考虑密码子偏倚和mRNA折叠等因素进行优化。例如“六个氨基酸”（6AA）和“ - 31密码子折叠优化”（31C - FO）方法，以及MPEPE、SoluProt等基于深度学习的预测模型，还有DeepTESR等用于构建翻译延伸短。

2.优化策略有效性验证

各种优化策略对提高蛋白表达效率具有一定的有效性。例如，密码子优化工具如OPTIMIZER和DNA Chisel能显著提高一些基因的蛋白表达水平；融合标签能改善蛋白的表达和溶解性；基于大数据和深度学习的方法也能在一定程度上提高蛋白表达或对其进行有效预测。

3.适用范围和局限性

不同优化方法有其适用范围和局限性。例如，密码子优化方法需要综合考虑多种因素，单纯的密码子频率优化可能效果不佳；融合标签技术虽然能提高表达水平，但部分标签可能导致蛋白不溶，且其作用机制尚不完全清楚；基于大数据和深度学习的方法需要大量数据支持，且对于一些复杂的基因表达情况可能仍存在预测不准确的问题。通过本研究，为解决大肠杆菌中异源蛋白低表达或不表达问题提供了全面的理论基础和实践指导，同时也为未来进一步优化大肠杆菌表达系统提供了方向。