微生物衍生的吲哚通过微生物交叉喂养减轻肠道炎症并调节肠道微生物组

以微生物群失衡为特征的肠道菌群失调与炎症、氧化应激和多种疾病有关，包括代谢紊乱和炎症性肠病。微生物群或宿主分泌或修饰的代谢物介导宿主-微生物群相互作用。它们构成了一个复杂的网络，共同维持宿主、微生物群的功能及其相互依存关系。粪便微生物群移植已成为一种很有前途的疗法，用于治疗菌群失调驱动的疾病，恢复肠道微生物群稳态的策略可能有可能缓解这些情况。也有报道称，将发炎个体的微生物群转移到野生型、无菌受体会增加他们对结肠炎的易感性。尽管代谢物作为信号分子参与调节宿主免疫系统，并通过激活相关信号通路影响癌症化疗和宿主代谢的疗效，但这些小分子调节肠道微生物组的机制仍然知之甚少。

色氨酸是蛋白质合成的必需氨基酸，也是对宿主代谢和生理学至关重要的各种代谢物的前体。色氨酸可由宿主通过犬尿氨酸或血清素（5-HT）途径代谢，或由肠道菌群通过吲哚途径代谢。越来越多的证据表明，由各种微生物群代谢的吲哚衍生物，如吲哚-3-乳酸（ILA）、吲哚-3-丙酸（IPA）和吲哚-3-乙酸（IAA），对宿主免疫和肠道功能有深远影响。这些微生物群衍生的色氨酸代谢物已被证明可以通过与芳烃受体（AhR）或孕烷X受体（PXR）结合来增强肠道屏障，抵御病原体并影响宿主代谢。

菌群失调的恢复或相关疾病的改善通常伴随着几种特殊代谢物的增加，如短链酸（SCFAs）和吲哚衍生物，但是否是体内产生的这些增加的代谢物的直接影响仍然未知。这些代谢物是否以及如何发挥细菌间信号活性来调节微生物组同样需要阐明。在本研究中，我们选择了罗伊氏乳杆菌（一种具有调节肠道免疫和肠道菌群能力的益生菌）来研究吲哚菌在介导宿主-微生物群相互作用和微生物间通讯中的作用和机制。我们发现ILA是乳酸菌在缓解炎症和调节肠道微生物群中的关键分子。ILA通过细菌交叉喂养增加涉及色氨酸代谢的相关酶的表达，并在体内和体外促进微生物色氨酸代谢物（包括IPA和IAA）的合成。ILA对肠道微生物群的调节是微生物群依赖性的，并且在啮齿柠檬酸杆菌或DSS诱导的菌群不良作用条件下特异性增加吲哚水平，但在抗生素破坏微生物群的情况下不会增加。IPA 的抗炎和肠道屏障强化作用直接受PXR激活调节，而IAA的抗炎和肠道屏障强化作用则受微生物群依赖性调节。总之，这些结果共同表明ILA介导的微生物间通讯调节微生物组-宿主串扰，并与其他微生物群衍生的吲哚一起控制肠道稳态。

结果

1. 罗伊氏乳杆菌I5007通过调节肠道微生物群保护小鼠免受结肠炎

为了研究肠道微生物群是否参与罗伊氏乳杆菌介导的结肠炎缓解，采用了结肠炎-恢复-结肠炎-结肠微生物群移植（CMT）模型。简而言之，小鼠口服有或没有罗伊氏乳杆菌I5007 3周，然后用DSS诱导结肠炎再持续一周。然后让小鼠从结肠炎中完全恢复12天，然后进行第二轮7天的DSS诱导，并对DSS处理的小鼠的结肠微生物群进行相互移植。罗伊氏乳杆菌I5007在第一轮DSS处理中显着缓解了疾病活动指数（DAI）和结肠病理，而恢复12天完全恢复了两组DSS处理小鼠的肠道健康。有趣的是，DSS处理的小鼠的结肠微生物群在很大程度上恢复正常，而补充罗伊氏乳杆菌I5007的小鼠的结肠微生物群在第40天仍保持显着差异，。在第40天，用罗伊氏乳杆菌给药的DSS处理的小鼠中，由丰富度和Shannon指数指示的结肠微生物群的α多样性指数仍然急剧降低。此外，来自补充罗伊氏乳杆菌的小鼠的结肠微生物群显着减少了结肠固有层和肠系膜淋巴结中的Th17A细胞并增加了调节性T细胞。以上结果表明肠道微生物群可能参与罗伊氏乳杆菌介导的肠道炎症保护。

2. 罗伊氏乳杆菌的保护作用与吲哚衍生物的产生有关

进一步进行线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，以确定在有或没有罗伊氏乳杆菌I5007给药的DSS处理小鼠中富集的主要结肠细菌。结果显示，罗伊氏乳杆菌I5007显著富集了30个细菌类群（图1A）。有趣的是，那些富集的细菌类群大多是梭状芽胞杆菌（梭状芽胞杆菌XlVa、梭状芽胞杆菌XlVb和梭状芽胞杆菌IV），已知它们能够代谢色氨酸。DSS显着损害色氨酸的微生物代谢，血清中吲哚衍生物如吲哚-3-甲醛（ICA）、IPA和IAA的水平降低证明了这一点。相反，色氨酸的宿主代谢似乎增强，显示吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的活性显着增加（图1B）。另一方面，罗伊氏乳杆菌的给药在很大程度上将DSS处理的小鼠的ICA、IAA和IPA的血清浓度以及IDO活性恢复到健康水平（图1B）。此外，罗伊氏乳杆菌也恢复了血清中5-HT和色氨酸的水平，但对犬尿氨酸或ILA没有影响。结肠组织的RNA测序进一步鉴定了DSS处理小鼠中响应罗伊氏乳杆菌I5007的4680个差异表达基因（图1D）。KEGG通路富集和基因集富集分析显示，罗伊氏乳杆菌给药下调了炎症相关通路，如TNF和NF-κB信号传导。距离差异的相关性分析进一步表明，IPA与微生物群和宿主基因表达的相关性最强，而IAA仅与微生物群组成显著相关（图1D）。正如预期的那样，在罗伊氏乳杆菌的响应下，IPA受体Pxr（也称为Nr1i2）和PXR靶基因Ugt1a1和Cyp3a11在DSS处理小鼠的结肠中的表达显著增加（图1D）。加权基因共表达网络分析显示，存在与IPA和IAA显著相关的共同宿主基因和细菌分类单元（图1E）。

图 1 罗伊氏乳杆菌改变肠道菌群组成和微生物色氨酸代谢

3. IPA和IAA均可改善DSS诱导的结肠炎

为了直接评价主要微生物色氨酸代谢物对肠道炎症和粘膜屏障功能的保护作用，将20和40 mg/kg IAA或IPA分别给予有或没有DSS治疗的小鼠7天（图1A）。IPA和IAA均显著逆转了DSS诱导的体重减轻、结肠长度增加、结肠病理减少、杯状细胞增加以及结肠中IL-1β和TNF-α基因表达降低，同时增加了E-钙粘蛋白和闭塞素的蛋白表达，表明IAA和IPA都能够缓解肠道炎症和增强粘膜屏障功能。

结肠微生物组分析进一步显示，IAA显着改变了DSS处理小鼠结肠微生物群的α和β多样性，而IPA仅具有边际效应，表明微生物群受IPA和IAA的差异调节。为了进一步评估IPA和IAA介导的对DSS处理小鼠的保护是否取决于肠道微生物群，小鼠用抗生素治疗2周以消耗肠道微生物群，然后口服IPA、IAA或IPA和IAA的混合物，有或没有DSS治疗（图2A）。IPA或IPA/IAA混合物能够保护抗生素处理的小鼠免受DSS诱导的结肠炎，而IAA的保护作用，如体重减轻、结肠长度、肠道屏障和炎症所示，被消除（图2B-G）。表明肠道微生物群在IPA和IAA保护小鼠免受肠道炎症方面的参与存在差异。

图 2 IPA和IAA改善DSS诱导的结肠炎

4. 罗伊氏乳杆菌通过合成 ILA 改变微生物色氨酸代谢

尽管罗伊氏乳杆菌显着增加了DSS处理小鼠的IPA和IAA血清浓度（图1B）。但是ILA，而不是ICA、IPA或IAA，是由罗伊氏乳杆菌和其他几种乳酸菌合成的，这与早期对乳酸菌和双歧杆菌的观察结果一致。罗伊氏乳杆菌培养物的色氨酸补充也显著增加了ILA合成。微生物色氨酸代谢涉及多种酶促反应，ILA是一种关键的中间体（图3A）。对补充或不含罗伊氏乳杆菌I5007的DSS处理小鼠的结肠微生物群的宏转录组学分析显示，虽然DSS抑制了参与色氨酸代谢的大多数细菌基因的表达，但罗伊氏乳杆菌显着增加了酰基辅酶A脱氢酶（ACD）、吲哚乳酸脱氢酶（ILD）和吲哚乙酰胺水解酶（IAAH）的mRNA表达，降低了吲哚丙酮酸脱羧酶（ID）的表达（图3B和C），表明罗伊氏乳杆菌更喜欢ILA、IPA和IAA的合成。此外，编码ACD和IAAH的梭菌的相对丰度在罗伊氏乳杆菌给药后增加（图3D和E）。

图3 罗伊氏乳杆菌改变参与色氨酸微生物代谢的主要酶的表达

5. ILA改善DSS诱导的结肠炎并改变肠道微生物群组成

为了进一步检查ILA的保护作用是否取决于肠道微生物群，小鼠用抗生素治疗2周以消耗肠道微生物群，然后进行DSS治疗，有或没有ILA补充剂。结果表明，相对于常规小鼠，ILA对微生物群耗尽小鼠的体重减轻和结肠缩短的保护作用显着减弱。已知ILA通过激活AhR发挥其保护作。为了检查AhR的药物抑制是否消除了ILA介导的肠道炎症改善，在DSS治疗期间，小鼠服用 CH223191（一种AhR抑制剂）和ILA。令我们惊讶的是，即使在存在CH223191的情况下，ILA也能提供重要的保护，如体重减轻、结肠长度和组织病理学所示。因此，我们得出结论，微生物群调节可能是IAA激活AhR对肠道炎症发挥保护作用的另一种途径。

为了确认ILA、IPA和IAA是否能够在不同的结肠炎模型中保护小鼠免受肠道炎症，将ILA、IPA或IAA口服到IL-10小鼠中4周。ILA和IPA均显著抑制IL-1β和IL-6 mRNA的结肠表达，而IAA的作用较小（图4A）。ILA和IPA还能够将结肠中的TNF-α和LPS恢复到健康水平，在IAA中观察到边际效应（图4B）。总体而言，这些结果表明，ILA和IPA在DSS和IL-10中保护小鼠免受肠道炎症方面比IAA更有效（图4C）。重要的是，补充ILA显着提高了乳酸菌的相对丰度（从6.45%到39.58%），而IPA富含双歧杆菌（从0.01到0.81%）和阿克曼菌（从0.21到10.37%）（图4D）。ILA和IPA也增加了Blautia的相对丰度（分别从0.06%增加到1.25%和1.22%）。共生网络显示Blautia和双歧杆菌是微生物网络中响应ILA和IPA的关键细菌类群（图4E）。值得注意的是，IPA具有最复杂的微生物特征网络（图4E）。综上所述，这些结果表明肠道菌群可能参与ILA和IPA介导的结肠炎缓解。

图 4 吲哚衍生物减轻IL-10小鼠肠道炎症

6. ILA 通过体内和体外微生物交叉喂养增加 IPA 和 IAA 的产生

因为只有ILA是罗伊氏乳杆菌合成的唯一色氨酸代谢物，在补充罗伊氏乳杆菌的DSS小鼠中IPA和IAA的增强合成可能是其他肠道细菌利用ILA作为底物的结果。为了直接确认ILA是否通过微生物交叉喂养增加IPA和IAA的产生，我们将ILA与DSS处理的小鼠的结肠微生物群一起孵育，发现ILA显着增加了 IPA和IAA水平（图5A）。微生物组分析表明，ILA显着改变了微生物群的组成（图5B）。PICRUSt2的功能宏基因组预测显示，ACD、ID和ArAT的表达响应ILA增加（图5C）。丰度网络显示，ACD具有最高程度的相互作用，与几个差异富集的细菌属表现出很强的正相关（图5D）。此外，正如PICRUSt2预测的那样，向DSS处理的小鼠口服ILA也显着增加了结肠微生物群中ACD和IAAH的表达（图5E和F）。为了进一步验证ILA促进其他吲哚衍生物的产生，我们将色氨酸、罗伊氏乳杆菌I5007、CFS和ILA与孢原梭菌共培养，孢子菌是一种特异性的产生IPA的细菌。正如预期的那样，罗伊氏乳杆菌的ILA和CFS显着增加了IPA的产生，但没有增加IAA（图5G）。总的来说，这些数据表明ILA可能被细菌用作产生IPA和IAA的底物。

图5 ILA在体外促进IPA和IAA的微生物产生

为了进一步检查ILA是否通过体内微生物交叉喂养促进IPA和IAA的产生，我们用抗生素处理小鼠以消耗肠道微生物群，然后补充热灭活或ArAT缺陷的罗伊氏乳杆菌突变菌株（ΔArAT），有或没有口服ILA（图6A）。热灭活和ΔArAT罗伊氏乳杆菌都未能保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎（图6B和C）。的值得注意的是，热灭活和ΔArAT罗伊氏乳杆菌不能促进IPA和IAA的产生，而对接受热灭活或ΔArAT突变菌株的小鼠施用ILA导致结肠内容物中两种代谢物的合成增加（图6D和E）。这些结果证实，ILA是罗伊氏乳杆菌产生的主要色氨酸代谢物，负责胃肠道中IPA和IAA的微生物合成。

为了进一步验证ILA是否根据肠道微生物群增强IPA和IAA的产生，我们要么用抗生素破坏微生物群，要么用啮齿类柠檬酸杆菌或DSS诱导不良生物，有或没有口服ILA（图6F）。微生物组分析表明，ILA对健康的、啮齿齿状体攻击或抗生素处理的小鼠的微生物α和β多样性没有影响（图6G和H）。值得注意的是，ILA在两种营养不良小鼠模型中仍然基本有效。ILA显着增强DSS处理小鼠的IPA和IAA，ILA未能促进抗生素处理的小鼠中IPA或IAA的合成（图6G和H），清楚地表明肠道微生物群是ILA诱导的IPA和IAA合成所必需的。总的来说，这些结果表明ILA通过微生物交叉喂养增强了IPA和IAA的产生。

图6 ILA促进IPA和IAA的微生物合成

7. IBD患者微生物色氨酸代谢的改变

与我们在DSS诱导的结肠炎中的观察结果类似（图1B），IBD患者的宿主色氨酸代谢增强。然而，目前尚不清楚IBD患者的色氨酸微生物代谢是否像DSS处理的小鼠一样受到抑制。为了检测IBD患者负责色氨酸代谢的主要细菌基因的表达水平，我们从HMP2 IBDMDB队列中检索了宏转录组学并分析数据集，其中包括溃疡性结肠炎（n = 21）和克罗恩病（n = 46）患者以及健康对照（n = 11）患者的粪便样本。PCoA显示，负责色氨酸代谢的微生物群谱与健康对照不同，UC和CD患者之间没有明显差异。在微生物代谢基因中，只有ACD显示UC个体显著减少。ACD主要由粪便样本中的粪杆菌（21.9%）、罗斯伯利亚（20.7%） 和普雷沃氏菌（7.5%）产生，它们在IBD患者中的丰度显着降低。总的来说，这些结果强烈表明IBD患者肠道微生物群的色氨酸代谢很可能减少。

结论

本研究表明，微生物群的组成和功能可能受到益生菌的调节。介导下游微生物群衍生代谢物的代谢物处理可能更能控制宿主-微生物群相互作用。利用内源性因素将微生物群从疾病纠正到健康状态可能有助于克服强烈的个体间变异性，这种变异性目前限制了药物治疗或益生菌干预的有效性。微生物群衍生的代谢物或靶向“后生元”可能为菌群失调驱动的疾病提供新的预防或治疗方法。