在癌症无创诊断领域，循环无细胞DNA（cfDNA）虽已广泛应用，但早期癌症患者血浆中cfDNA浓度极低，导致灵敏度和特异性不足。无细胞RNA（cfRNA）作为替代物，虽能反映细胞转录动态，但易被降解，且在临床样本中丰度极低（如几毫升血浆中仅微量存在），检测难度极大。 研究团队注意到，RNA的甲基化修饰蕴含超越序列本身的信息，且肠道菌群与结直肠癌的关联已被广泛证实——微生物的代谢活动和应激状态可能通过cfRNA传递到血液中。因此，探索微生物来源cfRNA的修饰模式，或能为癌症诊断提供新的标志物。 

技术为突破cfRNA检测的技术瓶颈，研究团队开发了低输入多重甲基化测序（LIME-seq）技术。该技术通过优化流程——移除易导致RNA降解的去甲基化步骤，采用HIV逆转录酶诱导碱基错配信号，实现了对多种甲基化修饰（m¹A、m³C、m¹G等）的同步检测，并能量化修饰比例。 LIME-seq的优势在于：其一，可捕捉血浆中占主导的短片段RNA（约50 nt，与tRNA大小接近），这类RNA因结构稳定、受蛋白质保护而不易降解，传统测序技术常因片段短而丢失；其二，在低输入量（1.5-50 ng）下仍保持高重复性，技术重复间相关系数达0.99，输入量差异（1.5 ng与50 ng）对结果影响极小（相关系数>0.96）。 实验验证显示，LIME-seq能精准识别HepG2细胞中tRNA的多种甲基化位点（如21种tRNA含m₂²G₂₆修饰），并同步量化其丰度，为临床样本分析奠定了基础。

通过LIME-seq分析36例健康人血浆样本，研究团队发现：血浆cfRNA中约20%-40%来自微生物，长度多为30-50 nt，可追溯至600余种肠道微生物，其中芽孢杆菌目、黄单胞菌目、伯克霍尔德菌目等5类占比超60%。 对比27例结直肠癌患者与健康对照的样本后，团队发现：癌症患者与健康人群的优势微生物类群存在重叠，但丰度模式不同，如伯克霍尔德菌在癌症样本中富集；癌症样本中微生物cfRNA的甲基化修饰水平整体升高，多数位点（如tRNA-Pro-TGG的m¹G₃₇）修饰比例显著上升，可能与肿瘤微环境引发的菌群代谢活性增强、应激反应相关；基于微生物cfRNA甲基化特征的诊断模型，采用留一法交叉验证（LOOCV）的AUC达0.98，准确率95%，远高于仅基于微生物丰度的模型（AUC 0.77）。在严格的bootstrap和k折交叉验证中，模型仍保持AUC 0.92，灵敏度93%、特异性92%，显著优于美国FDA批准的SEPT9甲基化检测（灵敏度约70%）。 更重要的是，该模型能有效区分不同癌症阶段，即使对0期患者也保持高准确性，这可能与菌群对异常细胞的早期响应有关。

该技术的临床转化价值体现在：（1）稳定性，血浆样本在4℃储存8小时后，微生物cfRNA的甲基化特征仍保持高相关性（相关系数>0.9），24小时后仍可接受（相关系数>0.85），满足临床样本处理的时间窗口需求；（2）扩展性，对胰腺癌样本的初步分析显示，微生物cfRNA甲基化模式也能区分癌症与健康人群，提示其可能适用于更多癌症类型；（3）精简性，模型可精简至12个高表达甲基化位点，兼顾稳定性与检测效率，在两个独立验证队列中AUC分别达0.89和0.93，进一步验证了可靠性。

参考文献

Ju CW, Lyu R, Li H, Wei J, Parra Vitela AJ, Dougherty U, Kwesi A, Luna A, Zhu X, Shen S, Liu Y, Wang L, Cui X, Xu Y, Jiang B, Ji Y, Xia P, West-Szymanski DC, Sun C, Zhong Y, Ye C, Moran A, Lehmann C, Pamer E, Zhang W, Bissonnette M, Zhang LS, He C. Modifications of microbiome-derived cell-free RNA in plasma discriminates colorectal cancer samples. Nat Biotechnol. 2025 Jul 8. doi: 10.1038/s41587-025-02731-8. Epub ahead of print. PMID: 40629040.