把肠道变成“进化工厂”—定向驯化益生菌，精准防治脂肪肝

针对益生菌定向进化技术应用不足、传统体外改造与基因编辑存在功能失效、效率低及监管风险等问题，立足宿主肠道是天然进化反应器、肠道选择压力可驱动细菌高频突变但缺乏靶向应用体系的现状，同时结合非酒精性脂肪肝（NAFLD）高发且与胆汁酸代谢紊乱密切相关、现有益生菌干预效果有限的临床需求，提出以无菌小鼠肠道为活体生物反应器，通过高脂高胆固醇饮食施加胆汁酸选择压力，实现益生菌体内定向功能强化，为 NAFLD 提供更有效的益生菌治疗方案，也为下一代定制化活体微生物疗法奠定基础。

主要研究结果如下：

1 体内定向进化大幅提升益生菌胆汁酸代谢能力，体外传代无效

首先从12株动物双歧杆菌乳亚种中筛选出本底胆汁酸代谢能力最强的H22B656作为出发菌株（图1b-e）。随后分别采用体外与体内两种策略进行定向进化：体外组在含0.3%结合胆汁酸的液体培养基中连续传代10天，但所有60个克隆的胆盐水解酶（BSH）比活性均未提高（图2a-b）。而体内组则将H22B656定植于无菌小鼠肠道，并逐步提高饲料脂肪含量（30%→45%→60%）以增加胆汁酸分泌压力，7周后从粪便中分离的60个克隆中有15个（25%）BSH活性显著升高，其中最优菌株WSS9的比活性较原始菌株提升了77%（图2c-d）。该结果表明，宿主肠道微环境提供的复杂选择压力是驱动益生菌功能进化的关键。

图1 婴儿衍生双歧杆菌菌株的实验设计与功能筛选

图2 体外和体内诱导策略增强胆汁酸代谢能力的比较疗效

2 全基因组与转录组解析揭示两个关键SNV驱动增强的胆汁酸代谢

对WSS9进行全基因组重测序和转录组分析，鉴定出282个高置信度单核苷酸变异（SNV）（图3a）。其中，非编码区SNV rs1846941位于胆盐水解酶基因cbh的上游启动子区，可能增强其转录；编码区SNV rs402499导致MDR外排泵蛋白第192位天冬酰胺置换为天冬氨酸（N192D）。转录组证实，WSS9中cbh和mdr基因的表达均显著上调（log2FC分别为0.48和0.54，FDR<0.001）（图成胆汁酸耐受与代谢的核心通路（图3e）。

图3 适应性B.animalis亚种乳酸W5S9中胆酸代谢增强的遗传和转录重塑

3 功能验证确认两个SNV分别增强基因表达与蛋白结合效率

通过构建mCherry报告质粒，将含有rs1846941变异或野生型的cbh启动子序列转入原始菌株，结果显示变异型启动子在三种胆汁酸（脱氧胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸）处理下均显著增强荧光强度，证实该非编码突变提高了cbh的转录水平（图4c）。针对mdr的N192D突变，研究发现该突变型菌株在胆汁酸胁迫下mdr表达量显著高于野生型（图4f），且突变型MDR蛋白与三种游离胆汁酸的分子对接结合能更低、氢键数量更多，表明N192D突变增强了底物结合亲和力（图4h-i）。此外，mdr敲除实验证实该基因对胆汁酸胁迫下的细菌存活至关重要（图4g）。

图4 在适应型菌株W5S9中驱动胆酸代谢增强的两个关键SNVs的功能验证

4 适应性菌株WSS9在NAFLD小鼠模型中展现更优的防治效果

在为期8周的高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型中，每日灌胃WSS9（109 CFU）的小鼠体重净增长较模型组降低33.6%（p=0.0022），而原始菌株H22B656仅降低30.3%且无统计学显著性（图5e）。WSS9还显著改善了血清高密度脂蛋白、丙二醛、总胆固醇等指标，肝脏H&E和油红O染色显示其更有效地减少了肝细胞内脂质堆积（图5g-i）。靶向胆汁酸代谢组学分析表明，WSS9处理组中牛磺鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸等有害结合胆汁酸水平显著降低，且对初级胆汁酸生物合成通路的调控范围广于原始菌株（图6d-k）。此外，WSS9未引起明显的安全性问题，遗传稳定性良好。

图5 原始B.animalis亚种乳酸H22B656与适应型B.animalis亚种乳糖W5S9在预防饮食诱发NAFLD方面的比较疗效

图6 适应型B.animalis亚种乳酸W5S9在NAFLD小鼠中重新平衡肠道胆汁酸代谢

该研究首次将无菌小鼠肠道作为“活体定向进化反应器”，利用高脂高胆固醇饮食施加的持续胆汁酸选择压力，成功驯化出胆汁酸代谢能力显著增强的益生菌株WSS9。与传统体外适应性进化（通常需数月至数年且难以模拟宿主免疫、黏液、营养竞争等因素）相比，体内策略仅用7周即获得高效突变株，且进化成功率达25%，充分体现了宿主微环境作为进化引擎的优越性。多组学分析精准定位了两个关键功能SNV—一个调控cbh转录的非编码突变和一个改善MDR底物结合力的错义突变，两者协同增强了菌株对胆汁酸的解毒与外排能力。在NAFLD模型中，WSS9通过重塑肠道胆汁酸谱（降低毒性结合胆汁酸、恢复游离胆汁酸平衡）改善了肝脏脂代谢和炎症状态，其疗效显著优于原始菌株，且未破坏肠道菌群整体结构（与原始菌群相似）。该研究不仅为益生菌的功能优化提供了“体内进化-机制解析-疾病验证”的完整技术路线，也为基于肠道微生态的代谢性疾病干预开辟了新方向。未来需进一步在灵长类或人源化菌群模型中验证其转化潜力，并探索该平台在其他益生菌功能性状（如黏附、抗炎）定向进化中的通用性。

 参考文献：Han Z, Sun Z, Liu X, et al. Harnessing a germ‑free mouse gut bioreactor for directed evolution of probiotics to combat non-alcoholic fatty liver disease.[J]. Nature communications, 2026, 17(1): 3133-3133.