灵芝可治疗老人痴呆？我们有救啦！

人口老龄化导致神经退行性疾病的患病率越来越高，包括阿尔茨海默病、帕金森病和脑血管疾病^[1]。神经退行性疾病的主要指标是认知功能障碍，包括记忆的进行性恶化、行为异常和社会功能紊乱^[2]严重影响患者的身体和心理健康。然而，由于其复杂而模糊的机制，这种疾病的有效治疗仍然难以捉摸。

 

神经炎症是认知功能障碍的主要原因，许多报告表明神经炎症的过度激活导致广泛的神经元死亡，最终导致认知功能障碍^[3]。异常聚集的蛋白质在细胞内和细胞间的积累，可以诱导和维持小胶质细胞的炎症反应，从而激活其他炎症途径^[4]。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是一种蛋白质复合物，通过招募含有酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）的凋亡相关斑点样蛋白并将传感器蛋白桥接到炎性小体来调节先天免疫反应^[5]。这一过程的过度激活会导致大脑中的慢性炎症微环境，导致多种疾病的发病机制和进展，最终导致认知功能障碍^[6]。因此，抑制炎性小体激活是改善认知功能障碍的潜在治疗策略。

 

灵芝（Ganoderma.lucidum）是一种在中国有着悠久栽培历史的药用真菌^[7]，具有显著抗炎特性^[8]和免疫调节作用^[9]。其灵芝多糖可以抑制神经退行性疾病的小胶质细胞活化^[10]、增强阿尔茨海默病患者的认知功能和刺激神经祖细胞的增殖。此外，研究表明，肠道微生物群结构的破坏会通过影响神经炎症导致认知障碍^{[11, 12]}。而灵芝多糖可通过改变盲肠微生物群结构并产生更多的短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）来减轻葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠结肠炎^[13]。然而，灵芝多糖缓解认知功能障碍的机制尚不清楚。

 

为了解决这个问题，中国海洋大学蔡超团队在《Journal of Ethnopharmacology》上发表了文章《Ganoderma lucidum polysaccharide alleviates cognitive dysfunction by inhibiting neuroinflammation via NLRP3/NF-κB signaling pathway》，其团队从灵芝中分离出一种多糖（G. lucidum polysaccharide，GLP），并通过综合分析阐明了GLP的一般结构，系统研究了其在缓解认知功能障碍方面的生物活性。该研究报告可能有助于探索灵芝多糖治疗神经退行性疾病的潜力^[14]。

 

 

1 多糖的提取及结构分析

基于多糖的结构和水溶性，研究人员通过碱提取获得灵芝多糖GLP，最高回收率为2.20%（图1A），对GLP的单糖组成分析结果表明，GLP主要成分为β-葡聚糖（图1B）

 

随后，对于GLP的结构分析数据表明，GLP是一种含有多种氨基酸的多糖，包括天冬氨酸（aspartic）、谷氨酸（glutamic）、丝氨酸（serine）、甘氨酸（glycine）、组氨酸（histidine）、精氨酸（arginine）、苏氨酸（threonine）、丙氨酸（alanine）、脯氨酸（proline）、酪氨酸（tyrosine）、缬氨酸（valine）、蛋氨酸（methionine）、异亮氨酸（isoleucine）、亮氨酸（leucine）、苯丙氨酸（phenylalanine）和赖氨酸（lysine）共16种氨基酸（表1）。而通过HPSEC-MALLS-RI对GLP相对含量进行分析，其的相对分子质量（Mw）为43.72kDa（图1C）。

 

图1 GLP的提取步骤和结构表征分析

表1 GLP中的氨基酸组成及相对含量

 

2 GLP缓解认知功能障碍

为了评估GLP在缓解认知功能障碍方面的生物活性，本研究建立了一种慢性认知功能障碍小鼠模型并以低聚甘露聚糖钠胶囊（Sodium oligomannate Capsules，SOC）用作阳性对照。该胶囊可以修复肠道微生物群失调，抑制神经炎症，从而逆转认知功能障碍^{[11, 12]}。

 

本实验分为正常对照组（normal control，NC）、疾病对照组（disease control，DC）、DC_GLP和DC_甘露寡糖酸钠胶囊（DC_SOC）治疗组（DC_GLP组和DC_SOC组中GLP和SOC的日剂量为100mg/kg）。NC组在22-24°C的光暗交替条件下喂食正常饮食12小时、而DC、DC_GLP和DC_SOC组则喂食高脂肪高糖饮食（high-fat high-sugar die，HFFD），并在慢性不可预测的轻度应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）环境中暴露132天，每次刺激持续8小时，每10天循环一次，在缓慢刺激期间产生认知障碍。结果显示，CUMS会引起小鼠体重减轻（图2B），且DC_GLP和DC_SOC组具有和对照组相似的筑巢能力（图2C、D）。除此以外与DC组相比，DC_GLP和DC_SOC组逆转了新颖物体识别指数（novel object discrimination index; NODI）引起的认知功能障碍，并将功能恢复到NC组的同等水平（图2E-F）。DC_GLP组的治疗结果与DC_SOC组相似。因此，本文研究结果表明，GLP可以增强认知功能障碍模型小鼠的认知和识别能力。

 

图2 GLP可缓解认知功能障碍

 

3 GLP缓解认知功能障碍及其与肠道微生物群稳态调节的相关性

为了确定GLP的生物活性是否可以通过恢复肠道微生物群稳态来缓解认知功能障碍，研究人员测量了小鼠粪便样本中SCFA的水平。DC组的醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐和异戊酸盐的粪便浓度显著降低；然而，DC_GLP和DC_SOC组显示这些粪便代谢物显著增加（图3A）。对每组肠道微生物的进一步分析显示，样本同时存在73个属（图3B）。与NC组相比，DC组的肠道微生物组健康指数（gut microbiome health index; GMHI）显著下调，表明肠道健康和生态失调（图3C）。

 

图3 GLP可缓解认知功能障碍及其与肠道微生物群稳态调节的相关性

 

此外，通过主坐标分析（Principal Coordinate Analysis; PCoA）和主成分分析（Principal Component Analysis; PCA），观察到NC组和DC组之间存在显著差异。然而，GLP治疗显著改变了受HFFD/CUMS影响的微生物群结构（图3D-E），而SOC治疗没有导致显著变化。

 

在属水平上（图3F-G），与NC组相比，HFFD/CUMS诱导处理后，观察到拟杆菌属（Bacteroides），考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和红蝽菌科_UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-002）的丰度上调。相比之下，与DC组相比，经GLP处理后，Bacteroides，Phascolarctobacterium和Coriobacteriaceae_UCG-002的丰度降低，表明GLP具有调节菌群失衡的能力。

 

为确定GLP给药前后表现出显著变化的物种进行LDA效应大小（LDA Effect Size，LEfSe）分析（图3H-J）。数据显示，与NC组相比，DC组有8个分类群受到影响，其中5个分类群显示出显著变化（图3H）。用GLP处理后，与DC组相比，杜波西氏菌（Dubosiella）和梭菌属_1（Clostridium_sensu_stricto_1）的丰度有所降低（图3I）。然而，与DC组相比，DC_SOC组在五个分类群中表现出变化（图3J）。特别是，DC_SOC组中埃希氏菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）和厚壁菌门（Roseburia）的相对丰度高于模型组。总体而言，这些发现表明GLP在调节DC组的肠道微生物群中起着重要作用。

 

4 GLP缓解认知功能障碍及其与外周免疫系统激活的相关性

据报道，从灵芝中提取的多糖具有独特的免疫调节功能^[15]。Raw264.7细胞作为常驻外周免疫细胞，用于研究GLP的外周免疫调节活性。实验结果显示，GLP对Raw264.7细胞没有细胞毒性（图4A），GLP处理后，一氧化氮（NO）水平以剂量依赖的方式显著上调（图4B）。

 

此外，GLP治疗后，促炎相关基因的表达上调，包括TNF-α和IL-1β（图4C-D）。此外，与对照组相比，DC组小鼠脾脏中的免疫细胞CD45+细胞的比例降低。相反，GLP处理后免疫细胞数量比例升高（图4E-F），这表明GLP可以激活小鼠外周免疫并恢复免疫稳态。

 

使用免疫荧光进一步研究GLP靶向的特异性免疫细胞，以检测脾脏中的F4/80（巨噬细胞标志物）和胸腺中的CD4、CD8（T细胞标志物）。DC_GLP和DC_SOC组都能够逆转DC组诱导的巨噬细胞、CD4和CD8 T细胞的减少，使其恢复到NC组中观察到的水平（图4G-J），即GLP可能通过调节外周免疫反应来缓解认知功能障碍。

 

图4 GLP缓解认知功能障碍及其与外周免疫系统激活的相关性

 

5 GLP可以通过NLRP3/NF-κB信号通路抑制炎症小体的激活来缓解认知功能障碍

通过评估小鼠海马体中小胶质细胞活化标志物IBA1的表达，研究了它们对GLP对神经炎症的反应。结果显示，与DC组相比，DC_GLP和DC_SOC组海马体CA1和CA3区的IBA1水平均降低，而DG组没有明显变化（图5A-B），表明GLP可以显著抑制神经炎症。

 

为了进一步了解其潜在机制，利用BV2细胞在体外评估GLP对神经炎症相关通路的影响。在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激下，BV2细胞在基因水平上表现出炎症因子的显著上调，包括NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β、TNF-α和iNOS。然而，GLP与LPS共同孵育导致这些炎症因子的相对表达降低（图6A-F）。同样，LPS诱导后，NLRP3、caspase-1、IKKβ和IL-18的蛋白水平显著升高。然而，当GLP与LPS共孵育后，NLRP3、caspase-1和IL-18的表达以剂量依赖的方式显著下调（图6G-H）。表明GLP具有强效抗炎作用。

 

此外，与DC组相比，DC_GLP和DC_SOC组皮质中NLRP3、caspase-1和IL-18的mRNA表达水平均表现出下调（图5C-G），且caspase-1和IL-18的蛋白表达也显著降低。先前的研究表明，NLRP3炎性体激活可能受转录因子NF-κB信号通路的调节^[16]。DC_GLP和DC_SOC组均能抑制DC组转录因子NF-κB信号通路相关基因IKKβ和p-p65水平的上调，而不影响总p65水平（图5H-I）。总的来说，GLP可能通过抑制NLRP3/NF-κB信号通路来抑制NLRP3炎性小体的激活，从而缓解认知功能障碍。

 

淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块的聚集和tau蛋白的过度磷酸化会引起神经炎症。对海马区的免疫组织进行化学分析结果表明，Aβ和p-tau蛋白未显示有任何可观察到的积聚（图5J）。说明HFFD/CUMS方案只会引起适度的认知功能障碍，并不会引发Aβ和p-tau蛋白的积聚。

 

图5 GLP在体内抑制神经炎症

 

图6 GLP通过NLRP3/NF-κB信号通路抑制BV2细胞炎症小体的激活

 

总而言之，研究人员从灵芝中分离出主要成分为β-葡聚糖的GLP。该多糖不仅可以有效缓解HFFD/CUMS模型引起的认知功能障碍，还能调节肠道微生物群的组成，并增强外周免疫功能。此外，GLP显示出抑制神经炎症的能力，可能是通过NLRP3/NF-κB信号通路抑制炎性小体激活，这可能有助于改善认知功能障碍的表现。因在多种生物途径上具有协同作用，GLP可能对于针对神经退行性疾病的新疗法开发具有无限的前景与潜力。

 

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