现场友好型超快速检测平台，无需核酸提取即可进行病毒检测

　　聚合酶链反应(PCR)技术是医学诊断、病毒和细菌检测以及食品安全的主要方法。然而，PCR通常需要1小时以上才能扩增纯化的核酸。这取决于聚合酶的扩增效率和PCR装置的温度变化率。然而，对于超快速PCR(UF-PCR)器件具有快速温度变化的紧凑结构缺乏全面的研究。对于现场检测，需要便携式、超快速和灵敏的仪器。最近，已经开发了一些小型化的PCR系统来克服这些问题，即具有微流控芯片的芯片实验室技术。仪器的改进加速了UF-PCR的发展。开发了一种用于特异性检测慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)的超快速定量聚合酶链反应(UF-qPCR)。EvaGreen采用UF-PCR检测两种转基因马铃薯事件(SPS-Y9和EH92-527-1)。它可以检测到低至0.5%的转基因掺入。采用UF-PCR快速检测加工食品中的荞麦过敏原DNA。以上表明，UF-PCR和UF-qPCR经常用于检测食物、病毒和病原体。这些技术仍然需要昂贵且耗时的核酸提取，即使扩增阶段所需的时间更短。它降低了检测效率，阻碍了现场检测和床旁检测。因此，检测中无核酸提取纯化是未来研究的重点领域，也是当前趋势。此外，通常使用SYBR green和EvaGreen等荧光染料来输出信号。这些方法的精确度较低，因为它们无法防止引物二聚体和非特异性扩增引起的假阳性。因此，需要引入更具体的方法。

　　方法：构建了基于UF-PCR和CRISPR/Cas12a的超快速和无核酸提取检测平台来检测LSDV。该平台利用了RoomTemp样品裂解试剂盒，可在3分钟内实现样品裂解，并可立即应用于扩增。UF-PCR可在15分50秒内完成40个循环扩增。该平台还从灵敏的CRISPR/Cas12a系统生成了两个信号-荧光和侧向层析试纸(LFD)。通过两种信号模式，该平台可以满足便携性、可视化和特异性的目标。

　　结果：在图4(A)中，LSDV的不同浓度范围为2 106至 2 × 102拷贝·μL-1在T线上表现出明显的条带。即使在2 × 106拷贝·μL-1和1 × 106拷贝·μL-1的浓度下，只有T线显示信号，而C线不显示信号。由于靶标浓度过高，更多的Cas12a被激活以切割LFD-ssDNA报告基因，导致系统中没有完整的报告基因。T线的积分密度随着浓度的降低而降低，如图4(C)所示。这表明T线的积分密度与目标浓度呈正相关。而1 × 102拷贝·μL-1的结果与对照组相同。因此，LFD的实际检出限低至2×102拷贝·μL-1.LFD可以在短时间内完成信号输出，实现视觉检测。

　　图4. LFD的敏感性性能(A)和特异性分析(B)。不同浓度(C)和不同病毒(D)的LSDV的T线积分密度。

　　结论：使用便携式UF-150仪器，UF-qPCR和RoomTemp样品裂解试剂盒在18分钟内完成了样品处理、核酸扩增和检测，比传统的qPCR快得多。此外，该平台介导了CRISPR/Cas12a，以提高灵敏度并提供更方便的读取模式。通过荧光和LFD，该平台实现了便携性、可视化和高灵敏度，适用于床旁检测。平台的检测限为2 × 101拷贝·μL−1.此外，该方法对实际样品具有较高的准确度。

　　参考来源：Cao G, Xiong Y, Qiu Y, et al. Field-friendly and ultra-fast detection platform without nucleic acid extraction for virus detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2023. 1280: 341865.