一种基于硫化噬菌体展示纳米抗体的单一生物传感器用于无标签检测食源性病原体的生物传感器

　　背景：

　　比色生物传感因其视觉读数、便携性和成本效益而在环境监测、食品污染物分析和医学诊断中引起了相当大的关注。AuNPs是生物传感器开发的优良信号指示剂 ，具有易于制备、生物相容性、高消光系数和独特的局部表面等离子体共振(LSPR)特性等优点。纳米颗粒间距离减小引起的Au-NPs交联可诱导金聚集，导致溶液颜色由红色变为紫色，肉眼容易辨别。最近，已经报道了基于AuNPs聚集的比色生物传感器用于检测各种靶标，包括霉菌毒素，病原体和生物酶。选择性可以通过用抗体，适配体和特异性肽等制造来实现。

　　噬菌体具有在很宽的温度和pH值范围内具有高稳定性的优点，在生物传感器应用中作为生物受体具有巨大的潜力。然而，天然噬菌体很难满足实验所需的宿主特异性。大多数天然噬菌体的繁殖性能较差，方案标准化困难。此外，天然噬菌体的大规模应用容易产生噬菌体污染，从而影响工业生产。基于噬菌体的生物传感器通过基因工程获得的噬菌体表面上显示的特定蛋白质感染或识别靶标来实现细菌的分析。单域抗体，也称为纳米抗体(Nbs)，来源于单峰骆驼重链抗体，是可以显示在噬菌体颗粒表面的有效配体。通过向所需目标进行多轮平移，可以从文库中选择特定的噬菌体显示的Nbs(噬菌体-Nbs)，并且可以通过DNA测序鉴定纳米抗体的序列。Nbs已广泛应用于霉菌毒素、农药残留和生物标志物检测。噬菌体-Nbs结合了抗体的高特异性和噬菌体的稳健性、易生产特性，已被用作食源性病原体和相关毒素的免疫测定中的检测抗体，包括沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和葡萄球菌肠毒素等。然而，这些策略需要一对抗体和相对较长的检测期。

　　方法：本文以副溶血性弧菌为模型靶点，建立了基于硫代噬菌体-Nb介导的AuNPs聚集的一步法无标记比色生物传感器。副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性杆状细菌，通常在海鲜中被发现污染。首先使用免疫骆驼血清构建噬菌体-Nb文库。通过三轮生物淘洗，获得了副溶血性弧菌特异性的噬菌体-Nbs。硫醇化后，噬菌体表面的硫醇基团诱导AuNPs聚集，而与细菌的相互作用则阻止了由于空间位阻而聚集的聚集，导致溶液颜色和光强光谱发生变化。

　　结果：观察到溶液从紫色到红色的明显颜色变化，表明存在副溶血性弧菌。该检测肉眼测得的检测限(LOD)为104 CFU/mL(图6a)。此外，∆(A524/A682)在细菌浓度方面具有良好的四参数logistic关系。定量LOD为∼103 CFU/mL，定义为空白值加上标准偏差的3倍(图6b-c)。图6d表示，仅在副溶血性弧菌存在的情况下观察到阳性∆(A524/A682)值，而其他细菌产生的响应信号与空白溶液的响应信号几乎相同。这些结果证明了所提出的副溶血性弧菌比色法的高特异性。

　　图6. 通过一步比色免疫传感器检测副溶血性弧菌，包括(a)肉眼和(b)紫外-可见光谱法。(c)所提出的免疫传感器的校准曲线。(d)免疫传感器对9种非靶向食源性病原体(金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、伦敦葡萄球菌、肠炎链球菌、痢疾链球菌、大肠杆菌、河流弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌)和副溶血弧菌的特异性，浓度为106 CFU/mL。

　　结论：展示了一种基于硫代噬菌体-Nbs诱导的AuNPs聚集的新型传感器平台，用于快速、灵敏和选择性地检测细菌病原体。在该策略中，从免疫噬菌体显示的纳米抗体库中选择的噬菌体Nb能够特异性识别副溶血性弧菌。噬菌体表面pVIII蛋白硫代化后，噬菌体-Nb-SH能够诱导AuNPs聚集，而靶细菌的存在保护了纳米颗粒不聚集，导致SPR吸光度和可见溶液颜色发生变化。在最佳条件下，视觉检测限为104 CFU/mL，该生物传感器在100分钟内定量检测限为106 CFU/mL。此外，未观察到对其他常见病原体的交叉反应。该策略允许使用单个噬菌体显示的纳米抗体对特定病原体进行简单、廉价、快速和灵敏的检测，该纳米抗体作为现场细菌分析的即时设备具有巨大的潜力。

　　参考来源：Wang P, Yu G, Wei J, et al. A single thiolated-phage displayed nanobody-based biosensor for label-free detection of foodborne pathogen[J]. Journal of hazardous materials, 2023. 443: 130157.