肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶的挖掘与应用

一、解聚酶基因的挖掘

目前在 GenBank 数据库中的肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶基因数量较少，而且有些以尾纤蛋白命名，不易查找。对肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶基因的挖掘可简要分为 2 步。首先，确定噬菌体能够合成解聚酶的最简易便捷的判断方法是观察噬菌体能否产生有晕环的噬菌斑，若能，则可初步推测噬菌体基因组中含有解聚酶基因；将噬菌体测序后与已有的解聚酶序列进行比对，选择相似度高的序列作为假定的解聚酶序列，由于不同解聚酶基因之间的差异较大，有时无法从所选取的噬菌体基因组中搜索到与在库解聚酶基因相似度高的基因片段，此时可选取基因组中的尾纤蛋白(TFP)或尾刺蛋白(TSP) 作为假定的解聚酶序列。在此基础上，利用解聚酶催化结构域通常为单链右手 β-螺旋结构的特性，可以对所选基因进行蛋白二级结构预测，观察其是否具有单链右手 β-螺旋结构，以此可作为早期判断基因序列是否为解聚酶序列的辅助依据。初步挖掘完成后，针对所选基因构建表达载体，表达对应蛋白测定其解聚酶活性。

二、解聚酶的分析与鉴定

对肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶的分析策略需结合实际情况进行设计。有研究发现 70 °C处理噬菌体 P13 30 min后，噬菌体全部失活，但其解聚酶活性仍保持在 90%以上，由此推断该噬菌体所编码的解聚酶具有热稳定性，随后，通过向噬菌体悬液中加入丙酮、沉淀、超滤、离心、纯化等方法，成功地分离出一种热稳定解聚酶。临床实践也是鉴定解聚酶的有效方式。Wu等发现肺炎克雷伯菌噬菌体SH-KP152226 编码的Dep42 蛋白能够迅速分解 K47 荚膜，而且能显著降解和抑制生物，初步鉴定其为解聚酶，研究表明当解聚酶 Dep42 与抗生素联合使用时，可以增强多粘菌素对肺炎克雷伯菌生物被膜的抑制作用，提示解聚酶与抗生素联合使用可能是对抗耐药菌感染的新策略^[1]。

三、解聚酶的抗菌应用

随着解聚酶分析鉴定工作的推进，新的解聚酶不断被发现，探索解聚酶的应用成为热点。目前尚无解聚酶治疗人体细菌感染的实例，但在体外实验和动物实验中，解聚酶展现了良好的抗菌和治疗效果。Latka 等发现由 KP34 噬菌体解聚酶、不产生解聚酶的噬菌体KP15和环丙沙星组成的三重鸡尾酒可显著降低生物被膜中的生物量，噬菌体KP34的解聚酶可以作为噬菌体的辅助性抗生物被膜制剂^[2]。Volozhantsev 等用致命的 K57 荚膜抗原型肺炎克雷伯菌株感染小鼠，0.5 h 后，以50 µg/ 只的剂量注射解聚酶 Dep_kpv79和Dep_kpv767，80%−100%的实验组小鼠存活^[3]。分析表明，解聚酶的治疗效果显著是因为其能够分解荚膜，使细菌暴露在免疫攻击下，如补体介导的杀伤。这些数据进一步证实噬菌体多糖解聚酶是一种很有前途的抗菌治疗工具。

[1]Wu YQ, Wang R, Xu MS, Liu YN, Zhu XC, Qiu JF, Liu QM, He P, Li QT. A novel polysaccharide depolymerase encoded by the phage SH-KP152226 confers specific activity against multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae via biofilm degradation[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 2768

[2]Latka A, Drulis-Kawa Z. Advantages and limitations of microtiter biofilm assays in the model of antibiofilm activity of Klebsiella phage KP34 and its depolymerase[J]. Scientific Reports, 2020, 10: 20338

[3] Volozhantsev NV, Shpirt AM, Borzilov AI, Komisarova EV, Krasilnikova VM, Shashkov AS, Verevkin VV, Knirel YA. Characterization and therapeutic potential of bacteriophage-encoded polysaccharide depolymerases with βgalactosidase activity against Klebsiella pneumoniae K57 capsular type[J]. Antibiotics, 2020, 9(11): 732