利用病毒的灵活性来选择性地捕获和分析罕见的循环靶细胞，以精确地进行癌症亚型分型

导读：

由于缺乏具有强靶标结合亲和力和非靶标细胞抗性的捕获表面，从全血中有效分离稀有靶细胞(如循环肿瘤细胞)仍然具有挑战性。本研究的创新性在于，提出了一种利用细菌病毒(噬菌体)纳米纤维的灵活性的解决方案，其侧壁显示目标循环肿瘤细胞特异性适配体，其末端系在磁珠上。这种柔性噬菌体具有较低的刚度和杨氏模量，可以扭曲和适应识别细胞受体，在能量上增强靶细胞的捕获，在熵上阻止非靶细胞(白细胞)的吸附。与具有刚性噬菌体的磁珠相比，具有柔性噬菌体的磁珠可以分离和对抗靶细胞，细胞亲和力显著增加，非靶细胞吸收显著减少，并且揭示了病毒修饰固体表面的机械特性。

研究背景：

基于亲和力的表面生物检测，如酶联免疫吸附检测 （ELISA） 和免疫磁隔离，在临床诊断、环境监测和药物筛选中，具有至关重要的意义。但是各种基质成分(例如血液)的复杂生物样品非特异性吸附通过占据活性靶标结合位点或阻碍表面信号转导显著破坏了分析性能。

M13噬菌体表现为一种纳米纤维样细菌特异性病毒，长度为880nm，直径为6nm。M13纳米纤维的表面，可以通过基因工程或化学修饰轻松定制。因此，将M13组装到支架中，已经在各种应用中，取得了显著的成功。包括组织再生疗法、传感、甚至能量收集。该团队最近发现，M13噬菌体由于其摇摆运动，而能够加速液固界面的质量传递。

CTC起源于实体瘤并进入血液，在诊断肿瘤转移和评估预后方面，作为液体活检的靶标，具有重要前景。鉴于它们在血液中的稀有性，开发有效的基于亲和力的分离表面，势在必行。团队利用实验和模拟技术的混合，来展示适应性柔性M13噬菌体，在构建磁珠中的应用，形成可以紧密捕获CTC的可变形表面。这种设计，通过允许噬菌体扭曲，以最大限度地与CTC上的受体结合，并在熵上阻止WBC在该表面上结垢，来增强CTC的捕获。

研究进展：

一、 工程化噬菌体的力学性能和动态运动

本研究将背部修饰有靶向MUC1适配体的M13噬菌体定向锚定于磁珠（通过噬菌体端部展示的6His-tag和磁珠表面镍离子的螯合），构建可形变亲和界面A-f-M13-MB，并用于乳腺癌CTC捕获及分析。原子力显微镜(AFM)分析M13噬菌体具有低杨氏模量，在溶液中具有明显的扭转行为。用4%多聚甲醛(PFA)或100%乙醇(EtOH)处理噬菌体使其变为刚性，杨氏模量和刚度大幅增加，刚性的M13噬菌体比未经处理的柔性状态表现出更少的卷曲形态，在相同的流体剪切应力下，未经处理的柔性M13纳米纤维的变形是经过处理的刚性M13纳米纤维的1.65-1.74倍。柔性M13纳米纤维相对于刚性M13纳米纤维具有更大的空间构型自由度。

图1.柔性噬菌体可变形亲和界面高效分离全血中离循环肿瘤细胞

图2. M13噬菌体的力学特性

二、 灵活的M13有助于更好地捕获CTC

通过将柔性Apt-M13纳米纤维，固定在Ni-IDA MB上，以锻造A-f-M13-MB，使用MCF-7作为模型MUC1 CTC，评估了其与CTC的结合亲和力。适应性强的CTC捕获A-f-M13-MB表面的CTC结合亲和力，显著增加了。此外，A-f-M13-MB表面的CTC结合亲和力，比将适配体直接固定在MBs（即A-MB）上形成的表面的亲和力，高出约19,200倍。这凸显了柔性Apt-M13噬菌体的关键作用。有趣的是，用其他刚性噬菌体，替换柔性Apt-M13噬菌体，导致A-r-M13-MBs（A 代表“适配体”，r 代表“刚性”）的CTC结合亲和力，大幅降低了22.8倍。很明显，Apt-M13的灵活性，是CTC结合亲和力增强的主要驱动因素。

为了更深入地研究M13的灵活性，在影响CTC群体和亲和力固体表面之间的粘附力方面的作用，团队进行了基于离心的细胞粘附检测。实验结果揭示了柔性M13的粘附力，至少比刚性M13高18%。这一结果再次强调，M13固有的灵活性，有助于实现与CTC受体的稳健结合。

为了更深入地了解，由于灵活性而增强的多价相互作用，团队采用了耗散粒子动力学（DPD），探索CTC和MB之间复杂的分子水平相互作用。在模拟中，构建了3种不同类型的MB，即A-MB、A-f-M13-MB和A-r-M13-MB。实验结果显示，CTC受体可以同时与大量适配体，相互作用。与其他两种MB类型相比，CTCs和A-f-M13-MB之间的相互作用，在能量上最有利。这归因于M13锚定的适配体和CTC受体之间的接触增加。

值得注意的是，M13噬菌体和适配体的自由度，在MB表面的CTC吸附时，受到限制。这种还原，增加了相互作用的熵项（-TΔS），从而对吸附产生了熵威慑作用。然而，鉴于特异性受体-适配体相互作用的明显强度，在吸附过程中，相互作用能量优于这些熵因子。

图3. 柔性M13增强CTC捕获性能

三、扭曲的M13有助于减少WBC吸附

为了评估工程表面的防污性能，团队采用了人类伯基特淋巴瘤拉莫斯细胞，作为白细胞（WBC）的模型。实验结果显示，在孵化30分钟后，只有大约1,354个白细胞粘附在A-f-M13-MB上。与此形成鲜明对比的是，与A-r-M13-MB和A-MB结合的白细胞数量，分别高出7.5倍和8.9倍。相应地，基于离心的细胞粘附检测，揭示了A-f-M13-MBs的白细胞结合力，显著降低至8.64pN。值得注意的是，该力仅占观察到的A-r-M13-MB和A-MB结合力的1/3和1/6。

为了在分子水平上，更深入地了解这3个表面的不同防污特性，团队采用了DPD模拟。A-MB的RDF峰最高，而相互作用最低，从而使白细胞吸附在能量上，对A-MB最有利。另一方面，A-f-M13-MB和A-r-M13-MB的RDF峰和相互作用的能量几乎相同。这意味着白细胞吸附的能量概率相似。然而，当白细胞吸附到MB表面时，M13噬菌体和配体的自由度，都受到限制。重要的是，对于A-f-M13-MB，M13噬菌体和适配体的自由度都降低了；而对于A-r-M13-MB，只有适配体的自由度被削弱了。因此，A-f-M13-MB的熵项（-TΔS）高于A-r-M13-MB。熵项在决定相互作用自由能方面，比能量项更重要。这种动态，导致白细胞吸附在A-f-M13-MB表面上的熵优势，不如A-r-M13-MB。

图4. 柔性M13减少了白细胞的非特异性吸收

研究结论：

本研究利用基因工程和化学手段改造M13噬菌体，通过噬菌体纤维的柔韧性和特异亲和性，构建了一种兼具高亲和性和强抗污能力的亲和界面，实现从外周血中高效俘获和分离CTC，然后对分离的CTC进一步分析，确定肿瘤亚型。本研究揭示了病毒修饰固体表面的机械特性，柔性M13提高靶细胞结合亲和力的机理：固有的柔性和可变形性，赋予固体表面自我调节能力，从而通过能量驱动过程，放大位于M13上的适配体，与靶细胞上的受体之间的多价相互作用。柔性M13减轻与非靶细胞非特异性结合的机理：归因于熵驱动机制，即相对于刚性M13，柔性M13内的自由度损失更大。

参考文献：Li H.-D., Chen Y.-Q., Li Y., Wei X., Wang S.-Y., Cao Y., Wang R., Wang C., Li J.-Y., Li J.-Y., Ding H.-M., Yang T., Wang J.-H., & Mao C. (2024). Harnessing virus flexibility to selectively capture and profile rare circulating target cells for precise cancer subtyping. Nature Communications, 15(1), 5849. https://doi.org/10.1038/s41467-024-50064-y