由于巴氏奶杀菌条件温和，能够最大限度地保留原料奶中的营养物质和风味,深受消费者欢迎。然而，有研究表明近50%的液态奶在巴氏杀菌后会被来自加工环境及设施中的细菌污染。由于原料奶的质量以及巴氏奶在生产过程中存在的污染风险难以完全控制，因此选择一种合适的方法并开发一种快速、准确、实用性高的巴氏奶中致病菌的检测技术，对于保障消费者的安全具有重要意义。实际上,鲁棒性是反映系统有能力抵抗或克服不利条件的一种方式，在生物学研究中,鲁棒性意味着当生物系统受到外部环境或内部参数等确定因素的干扰时，仍然具有保持功能稳定性的能力。

巴氏奶中的主要致病菌特征：

阪崎克罗诺杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌是影响乳制品安全常见的致病菌。感染阪崎克罗诺杆菌会导致严重坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎，病死率可达40%-80%。大肠杆菌是自然界中分布最广泛的细菌,被认为是乳制品污染的重要指标，10-102CFU/g的感染剂量即可致病。沙门氏菌在散装牛奶中的分离率高达11%，感染沙门氏菌会导致肠道疾病、妊娠中断、休克及意志薄弱。

mPCR方法的主要检测原理：

mPCR方法‌是一种在常规PCR基础上改进并发展起来的新型PCR扩增技术，它允许在同一个反应体系里加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段。这种技术结合了常规PCR的特异性和敏感性，同时提高了操作的快捷性和经济性，展现了很大的灵活性。mPCR的原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同，但它在引物和PCR反应条件的设计方面表现出更大的灵活性，使得在同一反应中能同时对多个靶标进行诊断，从而大大提高了检测效率并降低了成本。

结论：

该实验建立了一种鲁棒性mPCR方法，可用于检测巴氏奶中的阪崎克罗诺杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌。该方法不仅提高了常规mPCR方法的实用性,还解决了巴氏奶货架期短与致病菌传统检测方法耗时长相矛盾的问题。经过优化和鲁棒性研究，该方法检测结果得到双重保护,且确定了具有稳定性的退火温度范围,保证了方法的稳定性和实用性，为乳品行业和监管机构提供了更加及时的检测手段。因此,本研究在理论和实用方面都具有重要价值。

图1 灵敏度和稳定性测试结果

关键发现：

引物的浓度是影响mPCR中条带扩增的关键,引物浓度偏低会降低目标DNA的扩增程度，引物浓度偏高会出现其他非特异性条带。循环数过低会导致目标PCR产物低，循环数过高则会导致非特异性条带的出现，通常来讲循环数一般在25-40之间。

为解决巴氏奶货架期短与致病菌传统检测方法耗时长相矛盾问题，建立一种检测巴氏奶中的阪崎克罗诺杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的鲁棒性多重聚合酶链式反应 (multip le polymerase chain reaction,mPCR) 方法，旨在常规mPCR的基础上深入研究,提高方法的准确性和稳定性。

全文链接：https://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CCJDLAST2&filename=SPKJ2023071000A