基于CRISPR的核酸检测检测方法是非常具体的，但它们并不快速、敏感或易于使用。问题的关键在于PAM序列的选择，相较于传统PAM序列，次优PAM序列的使用可以显著提高Cas12a介导的检测的速度、灵敏度和可靠性。

传统的PAM（ProtospacerAdjacentMotif）序列的特点

1.高亲和力：传统的PAM序列与Cas12a蛋白具有较高的结合亲和力。这种高亲和力使得Cas12a能够迅速且有效地结合到含有传统PAM序列的DNA底物上。

2.快速切割：由于高亲和力的结合，Cas12a对含有传统PAM序列的DNA底物进行切割的速度非常快。例如，在实验中观察到，含有传统PAM序列的DNA底物在30秒内就能完成切割。

3.竞争性切割：在同时进行等温扩增和切割反应的情况下，传统PAM序列的高亲和力和快速切割能力使得切割反应在竞争中占优势，从而抑制了扩增反应的进行，导致扩增产物的积累缓慢或不稳定。

4.检测延迟和不稳定性：由于传统PAM序列导致的高效切割，扩增产物的积累受到抑制，这导致了检测的延迟和不稳定性，降低了检测的灵敏度。

什么是次优PAM序列

次优PAM序列（suboptimalPAMsequences）是指在CRISPRCas系统中，与Cas蛋白结合的DNA序列，其结合亲和力低于常规的、最优的PAM序列（canonicalPAMsequences）。在CRISPRCas12a系统中，常规的PAM序列通常是TTTV（其中V可以是A、C或G），而次优PAM序列则是指那些结合亲和力较低的PAM序列，如TRTV、TTNT和YYYN等。

具体来说，次优PAM序列的低结合亲和力使得Cas12a的切割活性减弱，从而使得等温扩增反应能够更有效地进行，生成足够的扩增产物用于检测。相比之下，常规PAM序列的高结合亲和力会导致Cas12a的切割活性占主导地位，抑制扩增反应，导致检测信号的延迟或不稳定。因此，次优PAM序列的使用不仅提高了检测的速度和灵敏度，还增加了检测方法的灵活性和可靠性，使其在病毒检测等应用中具有显著优势。

基于次优PAM序列如何实现检测体系的构建？

1.构建一锅法反应体系：

在一锅法反应体系中，同时进行等温扩增（如RPA）和Cas12a介导的检测。次优PAM的使用使得Cas12a的切割活性降低，从而使得等温扩增过程能够更有效地进行。

2.加速反应速度：

由于次优PAM降低了Cas12a的切割活性，使得等温扩增过程能够更快地生成足够的扩增产物（amplicons），从而加速整个检测过程。研究表明，使用次优PAM的crRNA可以使得反应速度提高23倍。

3.提高检测的灵敏度和可靠性：

次优PAM的使用不仅加速了反应速度，还提高了检测的灵敏度和可靠性。相比于使用标准PAM的检测体系，次优PAM体系在检测低浓度目标时表现更好，且信号更为稳定和可重复。

4.机制理解：

在反应体系中，Cas12a的切割和等温扩增之间存在竞争关系。次优PAM通过降低Cas12a的初始切割活性，使得反应偏向于等温扩增，从而生成更多的扩增产物，最终提高检测的灵敏度和速度。

通过上述步骤和原理，利用次优PAM构建的检测体系能够在短时间内（如1015分钟）实现对目标病毒（如SARSCoV2）的高灵敏度和高可靠性的检测，且操作简便，适用于点对点诊断。

基于次优PAM序列构建检测体系的优势

次优PAM序列通过以下机制促进扩增反应，并提高检测的灵敏度和稳定性：

1.降低Cas12a的结合亲和力：次优PAM序列使得Cas12a与DNA底物的结合亲和力降低。这种降低的结合亲和力导致Cas12a对底物的切割速度减慢，从而减少了Cas12a对底物的消耗。

2.促进等温扩增：由于Cas12a对次优PAM底物的切割速度较慢，底物在反应早期得以积累，这有利于等温扩增（如RPA）的进行。等温扩增的加速进一步增加了底物的数量，为后续的Cas12a检测提供了充足的底物。

3.平衡切割与扩增：在传统的PAM底物中，Cas12a的强结合亲和力导致切割反应优先于扩增反应，这会延迟或阻碍扩增产物的生成，从而降低检测的灵敏度和稳定性。而次优PAM底物通过降低Cas12a的切割活性，使得扩增反应得以优先进行，从而提高了检测的灵敏度和稳定性。

4.加速反应速度：使用次优PAM序列的crRNA（CRISPRRNA）可以加速反应速度，使得检测时间缩短至1015分钟，这比使用传统PAM序列的反应速度快23倍。

5.提高检测的可靠性和重复性：次优PAM序列的使用不仅提高了检测的灵敏度，还增强了检测信号的可靠性和重复性，减少了样本间的波动。

综上所述，次优PAM序列通过降低Cas12a的结合亲和力，促进等温扩增，平衡切割与扩增反应，从而显著提高了检测的灵敏度、稳定性和反应速度。

关键发现

次优PAM的应用：研究结果表明，使用亚最优PAM可以显著提高CRISPR诊断的敏感性和可靠性。例如，使用亚最优PAM的spacer 4在检测双链DNA时的检测限为2.34 fM，而使用最优PAM时的检测限为234 fM。

研究前景

该检测方法具有操作简便、检测速度快、敏感性高等优点，未来有望在临床诊断中得到广泛应用，特别是在快速检测和现场检测方面。