用于生物标志物成像和肿瘤点诊断的光活化CRISPR/Cas12a传感器

近年来，基于CRISPR/Cas12a的传感策略因其快速、敏感的特点而显示出特定目标检测的巨大潜力。然而，“总是活跃的”生物传感器往往不足以操纵具有高时空控制的核酸传感。开发核酸传感设备仍然至关重要，这些设备可以通过远程应用的刺激在所需的时间和空间上被激活。本文将光激活与CRISPR/Cas12a系统集成，用于DNA和RNA检测，旨在为核酸传感提供高时空控制。

细胞范围内的光控CRISPR/Cas12a技术

尽管现有光控制CRISPR/Cas12a系统策略在避免脱靶反应和实现封闭、精确和高灵敏度核酸检测方面取得了一些突破。然而，尚未报道在细胞内生物成像和护理点(POC)检测领域开发光控CRISPR/Cas12a技术。

光控检测体系的实现途径

在CRISPR/Cas12a系统中，光控的实现涉及以下几个关键步骤：

1.光敏分子的引入：在CRISPR/Cas12a系统中引入光敏分子（如PCLinker），这些分子在特定波长的光照射下会发生光化学反应，如光解反应。

2.光解反应：当光敏分子受到特定波长的光（如365nm的紫外线）照射时，会发生光解反应，导致分子断裂，释放出原本被锁定的功能区域。

3.功能区域的释放与激活：光解反应后，原本被光敏分子锁定的功能区域（如crRNA）被释放，恢复其原有的结构和功能。例如，crRNA可以恢复其发夹结构，从而能够与Cas12a蛋白结合，形成活性复合物。

4.目标识别与信号输出：激活后的CRISPR/Cas12a系统能够识别特定的目标DNA序列，并启动非特异性的侧向切割活性，切割荧光报告分子（如FQ-Reporter或LFA-Reporter），从而产生可检测的荧光信号。

通过上述步骤，光控CRISPR/Cas12a系统可以在特定的时间和空间上精确调控其活性，避免非特异性反应，提高检测的准确性和灵敏度。这种光控策略不仅适用于体外检测，还可以扩展到活细胞内的生物成像和即时检测（POC）领域。

光控检测体系与试纸条技术相结合

试纸条（LateralFlowAssay,LFA）在本文中被用于与CRISPR/Cas12a系统结合，实现核酸切割信号的可视化，从而提供即时检测应用的潜力。具体作用如下：

1.核酸检测的可视化：试纸条与CRISPR/Cas12a系统结合后，可以用于检测HPV16等核酸分子。当样本中的目标核酸存在时，CRISPR/Cas12a系统会被激活，导致荧光信号的产生或特定标记物的切割。这些信号或标记物可以通过试纸条上的特定区域（如测试线和控制线）进行可视化，从而实现对目标核酸的快速检测。

2.即时检测应用：试纸条的设计使得检测过程简单、快速，并且可以通过肉眼直接观察结果。这种特性使得试纸条非常适合用于即时检测（Point-of-CareDiagnostics），即在患者身边或现场进行快速诊断。

3.提高检测的灵敏度和选择性：通过与CRISPR/Cas12a系统的结合，试纸条能够实现对目标核酸的高灵敏度和高选择性检测。论文中提到，这种方法的检测限（LOD）可以达到39pM，显示出其优异的检测性能。

4.用户友好和直观：试纸条的使用不需要复杂的仪器设备，检测结果可以通过肉眼直接关察，这使得检测系统更加用户友好和直观，适合在各种环境中使用。

关键发现

光激活机制：通过使用与crRNA互补的PC连接子（photocleavablelinker）来阻断CRISPR/Cas12a的切割活性，但在365nm紫外线照射下，PC连接子可以被光解，从而恢复CRISPR/Cas12a的活性。这种设计使得系统能够在需要时精确控制时间和空间上的激活。

多功能传感：该系统能够实现对不同类型生物分子的多重检测，包括HPV16和survivinmRNA的体外检测，检测限分别低至3.3pM和1.8pM。

活细胞成像：成功实现了在活细胞中对survivinmRNA的成像，显示了该方法在活细胞内靶标成像中的潜力。

即时检测应用：将测试条与CRISPR/Cas12a结合，实现了核酸切割信号的可视化，为即时检测应用提供了可能性。

研究前景

本文开发一种高效、灵敏且用户友好的生物传感系统，用于生物标志物的检测和即时诊断，特别是在活细胞成像和临床诊断中的应用。

参考来源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c05497