牛！同时检测多种病原体的荧光无扩增数字平台

传统的免疫测定缺乏敏感性，使其无法在早期污染阶段检测病原菌。基于PCR的分子诊断方法，如定量实时PCR，利用核酸引物进行具有单一病原体敏感性的DNA扩增，但这些方法需要DNA扩增并受气溶胶污染的影响。微滴式数字PCR是为更精确的核酸检测而开发的。该技术允许通过利用泊松统计分析来确定目标浓度，而无需标准曲线，从而对细菌核酸进行绝对定量。然而，其广泛的适用性受到昂贵的设备和复杂流程的限制。应探索一种有效的策略来简化数字PCR的工作流程并减少对昂贵设备和DNA扩增步骤的依赖。同时，目前的液滴数字检测在同时检测同一样品中的多种病原菌方面面临挑战。因此，迫切需要一种多重且用户友好的数字检测方法，以便在不扩增靶DNA的情况下同时检测多种病原菌。

如何使用检测平台？

数字检测由四个部分组成。第一部分是数字信号探针预处理（图1a），涉及DNA-PER链（第1步）、DNA-PS点（第2步）和UDNA-LP-MBs（第3步）的制备。DNA-PER链和DNA-PS点之间的杂交反应形成灰霉样荧光聚合物点（PER-PS-点）也在本部分（虚线框部分）中展示。第二部分是由丁酸梭菌（CbAgo）介导的三种病原菌DNA和六种不同的向导DNA（gDNA）的精确初级切割反应，其中两个颜色相似的gDNA靶向一个病原菌（图1b）。第三部分是通过DNA-LP-MBs、裂解的靶序列和PER-PS点之间的杂交反应对DNA-LP-MB进行荧光编码。切割的靶序列的一部分与LP-MBs表面的DNA互补，其余靶序列与PER-PS点的DNA链互补，其中靶序列用作偶联DNA-LP-MB和PER-PS点的桥梁（图1c）。最后一部分包括数字荧光探针显微成像、数字图像处理和通过基于AI的算法进行的数字读出。

图. 用于病原体多重检测的数字检测概述。（a）用于信号预放大的荧光灰霉菌样PS点的制备1. 用于DNA结合位点扩增的引物交换反应，例如鼠伤寒沙门氏菌。2. PS点的制备。3. 脂质体融合修饰磁珠的制备）。（b）由CbAgo介导的用于产生靶DNA序列的初级切割反应（PDB：6QZK）。（c）DNA-PER-PS-点、病原体靶序列和UDNA-LP-MB之间的杂交反应以制备数字探针。（d）由基于AI的荧光微球计数算法捕获和处理荧光图像以进行数字读数的工作流程。

检测三种病原菌

由于靶序列、DNA-LP-MB和PER-PS点介导的特异性杂交反应，因为它们的碱基是完全互补的，因此可以保持灵敏度。当碱基不匹配时，无法形成LP-MBs@PER-PS点。CbAgo蛋白的精确切割能力也是保证方法特异性的重要原因之一。此外，我们通过加标三种不同浓度的病原菌DNA来测试数字测定的非靶细菌回收率（¹⁰³，¹⁰⁴和^{106 CFU/mL}（鼠伤寒沙门氏菌），¹⁰²，¹⁰⁴和^{106 CFU/mL}）添加到实际未检测到的样品中，以验证多重检测。鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的非靶细菌回收率在90%至110%的范围内，表明数字检测可以实现多重检测，即使在复杂样品中也表现出优异的效果。这些发现突出了数字检测作为同时检测多种病原菌的稳健方法的潜力，这对食品安全和医疗保健具有重要意义。

结论

开发了一种数字检测方法，用于基于超亮PER介导的荧光PS聚合物点对三种病原菌进行多重和无扩增检测，用于信号预扩增。CbAgo精确切割反应保证了目标序列被准确切割并进一步与PER-PS点杂交，从而确保可以精确监测单个细菌产生的任何信号。对于未来的工作，首先，重点应放在探索便携式和高通量荧光成像设备上，以扩大从实验室研究到即时检测的应用场景。其次，与光学成像和AI的集成可能有利于实际应用，例如智能手机的高清摄像头。我们相信，使用基于PER的荧光信号预扩增策略的数字检测可以在病原菌的数字检测中显示出巨大的前景。

参考文献：

Wang Z, Ma A, Chen Y. An amplification-free digital assay based on primer exchange reaction-mediated botryoidal-like fluorescent polystyrene dots to detect multiple pathogenic bacteria[J]. ACS nano, 2024.