食源性疾病作为一项巨大的公共卫生挑战，已对人类健康和经济发展构成重大威胁。沙门氏菌是最具传染性和危险性的食源性病原体之一，对乳制品安全和肉制品安全构成巨大威胁。开发高效、敏感的沙门氏菌检测技术对于预防沙门氏菌引起的食源性疾病暴发和传播非常重要。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CRISPR -associated proteins，Cas）系统凭借其出色的靶基因识别能力，在核酸检测、基因编辑和细胞成像等领域得到了广泛应用。特别是，Cas12和Cas13蛋白的靶激活反式裂解活性可用于生物传感器的开发，DETECTR（基于Cas12a）和SHERLOCK（基于Cas13a）的开创性发明就是一个例子。基于CRISPR/Cas12的生物传感器由于其精确的核酸靶向能力和出色的切割能力，已成为快速、灵敏检测食源性病原体的新兴分析工具。这些基于CRISPR/Cas的生物传感器通常是利用荧光信号作为信号转导方法开发的。

CLICK17

点击反应（Click reaction），被称为生物正交反应，是斯克里普斯研究所Sharpless教授团队在2001年提出的。近年来，Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成点击反应（CuAAC）作为一种典型的点击化学反应，因其高效率和正交反应性能，成为生物传感领域中一种高效的信号放大策略。CuAAC通常需要高浓度的^Cu(I)(Cu+)，但^Cu+相对较差的稳定性在一定程度上限制了点击反应在分析化学领域的应用。值得注意的是，西蒙弗雷泽大学化学刘教授团队开发了一种DNAzyme（一个79 nt的单链DNA（ssDNA），命名为CLICK17），它可以在超低浓度的^Cu2+存在下催化叠氮化物-炔环加成点击反应。在^Cu2+存在的情况下，CLICK17可以催化叠氮化物-炔环加成点击反应，避免了额外还原剂将^Cu2+还原成^Cu+。

CRISPR/Cas与CLICK17双系统

在这项研究中，整合了CLICK17催化的Cu(II)AAC点击反应、CRISPR/Cas12a和重组酶聚合酶扩增（RPA）的优势，开发了一个基于点击化学的荧光生物传感平台。首先，RPA的高效扩增实现了生物信号的初始放大；其次，CRISPR/Cas12a不仅增强了生物传感器的特异性，而且实现了信号的第二次放大和转换。最后，引入了CLICK17催化的Cu(II)AAC点击反应，实现了荧光信号的输出。在该平台中，利用RPA扩增出肠道链球菌invA基因，RPA产物激活了Cas12a的反式裂解活性。值得注意的是，CLICK17取代了荧光团/淬灭剂标记的ssDNA （FQ-ssDNA）报告基因，成为了Cas12a的反式裂解底物。激活的Cas12a可以切割CLICK17，从而破坏CLICK17的“点击”活动。因此，断裂的CLICK17不能催化Cu(II)AAC点击反应。

肠道沙门氏菌的检测

在该研究中，为了评估CLICK17辅助的CRISPR/Cas12a荧光生物传感器的特异性，我们从C. sakazakii，E. coli，S. aureus，E. cloacae，L. monocytogenes，和S. flexneri等多种病原体中提取核酸。采用不同病原体核酸进行个体检测，评估click17辅助的CRISPR/Cas12a荧光生物传感器的特异性。有趣的是，click17辅助的CRISPR/Cas12a荧光生物传感器在这些菌种的个体检测中显示出高荧光响应。这是由于CRISPR/Cas12a的特异性识别能力和CLICK17的“点击”活动。相反，仅在肠道沙门氏菌中显示了微弱的荧光信号。这是因为肠道沙门氏菌的invA基因激活了Cas12a，而激活的Cas12a反式切割了CLICK17。破坏性CLICK17不能催化Cu(II)AAC点击反应产生强荧光信号。而且在牛奶、婴儿配方奶粉、橙汁和肉类样品中的肠道沙门氏菌具有较高的回收率及较低的变异系数。检出限低至1.0 CFU/mL，线性范围为6.0×^101~6.0×^{107 CFU/mL}。

^{Figure 1. Workflow of the Designed CLICK17-Assisted CRISPR/Cas12a Fluorescence Biosensor. (A) Schematic of the CLICK17-Assisted CRISPR/Cas12a Fluorescence Biosensor in the Presence of S. enterica (B) and in the Absence of S. enterica (C)[1]}

关键发现

• 整合了CLICK17和RPA的优势，开发了一个CRISPR/Cas12a介导的肠道沙门氏菌荧光生物传感平台
• 该生物传感器在多种干扰菌存在时具有良好的抗干扰能力，可准确检测不同添加的食品样品（牛奶、婴儿配方奶粉、橙汁和肉类）中的肠道沙门菌，回收率为92% ~ 104%。

研究前景

CRISPR/Cas与CLICK17双系统为食源性致病菌的分析提供了一种有前景的检测方法，并对其他食品危害因素的分析具有潜在的潜力。

参考文献

[1] Y. Liao, Y. Liu, Y. Feng, D. Zhen, F. He, Rapid Detection of Broad-Spectrum Pathogenic Bacteria Based on Highly Sensitive Proton Response of the Nucleic Acid Amplification SPQC Platform, Analytical Chemistry 96(17) (2024) 6756-6763. Doi: 10.1021/acs.analchem.4c00437