RPA辅助的CRISPR/Cas12方法与荧光侧向层析试纸条联手实现产肠毒素蜡样芽孢杆菌的快速检测

蜡样芽孢杆菌（B. cereus）是一种革兰氏阳性机会性食源性病原体，可产生三方肠毒素，感染后会导致两种典型的食物中毒症状，包括催吐综合征和腹泻综合征。据报道，产肠毒素菌株的患病率约为40-98%，远高于催吐菌株。快速准确地检测具有肠道致病潜力的菌株以保护人类健康至关重要。

RPA辅助的CRISPR/Cas12系统

成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas）系统是一种新型生物工具，具有基因编辑和转录调控等功能。近年来，它在分子检测领域也得到了长足的发展。CRISPR/Cas12a系统中Cas12a的反式切割活性在靶核酸附近不加选择地切割单链DNA（ssDNA），从而能够快速增殖检测信号。重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种等温扩增技术，可以在短时间内产生足够的扩增子，而无需热循环。CRISPR/Cas12a与RPA的结合可以提供双重特异性的核酸检测，确保结果更准确、更灵敏。

纸质侧向层析检测（LFA）

纸质侧向层析检测（LFA）因其便携性、经济性、易于操作和快速信号读取而被广泛用于核酸检测，成为一种很有前途的即时检测平台。然而，传统的核酸试纸条依靠双标记的扩增子来直接检测扩增产物，这些扩增产物容易受到非特异性扩增子和引物二聚体的影响，这可能会导致LFA结果假阳性。基于CRISPR/Cas12a使用的ssDNA报告基因探针开发LFA可以解决当前的局限性。然而，大多数市售的CRISPR核酸试纸都设计为位于对照线（C线）上方的检测线（T线），这与从T线流向C线的传统LFA有很大不同。此外，在高浓度靶标时通常不存在C线，这进一步使新手用户对结果的解释复杂化。

RPA辅助的CRISPR/Cas12系统联手荧光LFA

在这项研究中，使用RPA辅助的CRISPR/Cas12a同时具有荧光和LFA信号输出模式，建立了来自蜡样芽孢杆菌的两个三组分肠毒素基因nheABC和hblACD的检测平台（图1）。在整个实验过程中，首先通过RPA分别扩增每个肠毒素基因以获得足够的扩增子，然后激活携带相应crRNA的CRISPR/Cas12a的反式切割活性，导致ssDNA报告探针断裂，从而改变了荧光信号。此外，在具有独立C线的基于金纳米颗粒（AuNP）的LFA中，用名为FB-ssDNA的生物素化报告基因探针代替。

B. cereus的致病基因的检测

在该研究中，在没有B. cereus存在时，荧光探针AuNPs-anti-FAM通过与FB-ssDNA络合，并在T线上与链霉亲和素（SA）结合，导致T线呈红色。相反，在B. cereus存在时，T线为浅红色或无色，因为裂解的FB-ssDNA无法形成完整且足够的AuNPs-ssDNA-SA复合物，从而进一步使用典型的智能手机小程序来协助确定颜色变化（图1）。而且，在灵敏度和特异性的评估中发现，该检测平台在食品样中的灵敏度为^{102-103 CFU/mL}，与其他检测平台相当，且对除了蜡样芽孢杆菌组的密切相关成员（苏云金芽孢杆菌）外，与其他病原菌发生交叉反应。另外，该研究使用食品样品（包括牛奶和大米）进一步确定了检测平台的有用性。总之，基于一整套两个三组分肠毒素基因，该检测平台可以快速简单地检测食品中具有肠致病潜力的蜡样芽孢杆菌。

^{Figure 1. Schematic Diagram of the RPA-CRISPR/Cas12a Platform for Detecting B. cereus Which Produces Tripartite Enterotoxins [1]}

关键发现

首次使用RPA-CRISPR/Cas12a检测法同时检测整个nheABC和hblACD基因，用于检测产肠毒素蜡样芽孢杆菌。

构建了基于AuNP的独立C线试纸，价格实惠，并且与传统LFA具有相同的T/C线位置，符合用户的习惯，同时适合当前的智能手机小程序，可以结合使用，最大限度地减少视觉差异，而无需额外的应用程序开发。

研究前景

开发的RPA-CRISPR/Cas12a双信号可视化检测平台是快速、便携地检测产生三组分肠毒素的蜡样芽孢杆菌的有效工具。

参考文献

[1] P.-R., Li, Z.-X., Wang, Z.-K., Xu, J., Wang, B., Li, X., Shen, Z., Xu, An RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Assay Combining Fluorescence and Lateral Flow Strips for the Rapid Detection of Enterotoxigenic Bacillus cereus, J. Agric. Food Chem. 2024, 72, 24, 14000–14010. DOI: 10.1021/acs.jafc.4c03601