病原菌分布广泛，可导致严重疾病，包括肺炎、发烧和胃肠道不适，每年导致约500万人死亡，预计到2050年将超过1000万人。令人担忧的是，在食物样本和复杂环境中，经常同时发现多种致病细菌，而多重PCR允许同时检测多种病原菌，但它面临诸如引物设计复杂、扩增效率变化以及依赖准确定量和数据处理等挑战。因此，迫切需要探索一种能够同时识别多种病原菌而无需DNA提取和扩增的多重且用户友好的检测方法。

图1 基于二维荧光编码微球系统进行多重病原菌检测^[1]

基因编辑工具

近年来，基于基因编辑工具的生物传感器，如CRISPR/Cas和Argonaute系统，因其高特异性、灵敏度和速度而受到广泛关注。在这些系统中，来自丁酸梭菌（CbAgo）的Argonaute蛋白是原核Argonaute蛋白家族的重要成员。它具有通过与向导DNA（gDNA）配对来选择性切割靶DNA的独特能力，特别是通过第10个和第11个碱基之间的相互作用。基于这一特征，各种研究都使用荧光团-淬灭基团对标记的短寡核苷酸作为信号报告基因。CbAgo的激活导致这些序列的切割，从而导致荧光团和淬灭基团分离，产生荧光。

可编程的显微镜成像平台

在该研究中提出了一种可编程的显微镜成像平台，利用超亮、二维编码的荧光微球和基于CbAgo的系统对病原菌进行多重、灵敏和无扩增的检测。首先，使用四面体DNA增强杂交链反应（TDNA-HCR）创建多信号探针，生成标记有各种荧光团的超亮聚苯乙烯微球（PS-TDNA-HCR）。刚性TDNA结构通过固定发夹探针和优化荧光团密度来提高反应效率。这些PS-TDNA-HCR探针由荧光团颜色和粒径进行二维编码（图1）。

多重病原菌检测

在这项研究中，首先基于适配体的识别会将病原菌信息转化为gDNA，激活CbAgo切割初始DNA（iDNA），从而从PS-TDNA-HCR表面释放荧光团，从而放大荧光信号。基于计算机视觉（CV）的算法按颜色、大小和数量对这些荧光载体进行分类，允许同时检测多达四种病原菌类型。该检测平台在对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌和单核细胞增生李斯特菌的检测限分别能够达到39 CFU/mL、92 CFU/mL、46 CFU/mL 和 101 CFU/mL。且在患者样本和鱼类样本中均具有高准确性和有效性。

关键发现

首次报道了基于四面体HCR辅助荧光探针编码和CbAgo介导解码的可编程显微镜成像平台。

该方法为多种病原菌检测提供了一种超灵敏且无需DNA提取和扩增的方法。

研究前景

未来的工作将集中在几个领域：（1）结合材料科学开发多形状粒子以扩展多维编码能力。（2）开发信号读出设备，通过将微流体与微成像技术相结合，建立便携式、集成的检测平台。（3）结合CV驱动的分析平台以实现现场检测。我们相信这项工作具有广泛的应用，特别是在体外诊断和食品安全检测等领域，为检测病原菌提供了一种有效的手段。

参考文献

[1] M., Wang, L., Li, L., Wei, Y., Han, Y., Chen Multiplexed Pathogenic Bacteria Detection via a Two-Dimensional Encoded Fluorescent Microsphere System. Nano Lett. 2025, 25, 2256–2265. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c05471