无细胞合成系统助力个性化噬菌体疗法的突破性进展

随着抗生素耐药性的日益严重，全球范围内多重耐药性细菌（MDR）的增加已成为公共卫生的重大威胁。世界卫生组织（WHO）将MDR细菌列为全球最紧迫的健康威胁之一。面对这一挑战，噬菌体疗法作为一种替代传统抗生素的潜在方案，近年来受到越来越多的关注。然而，噬菌体疗法的广泛应用受限于噬菌体的快速生产、安全生物工程和详细表征的缺乏。近期，一项发表在《Cell Chemical Biology》上的研究提出了一种基于无细胞系统的个性化噬菌体生产平台，为解决这些问题带来了新的希望。

研究背景

抗生素耐药性问题导致了巨大的经济负担和高死亡率。例如，2014年美国因MDR细菌导致的医疗费用高达22亿美元，而欧洲每年因此死亡的人数超过3.3万。MDR细菌尤其在革兰氏阴性菌中更为严重，其中大肠杆菌（Escherichia coli）是主要的耐药菌之一。此外，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）等病原体也对公共卫生构成威胁。噬菌体疗法作为一种替代方案，已在比利时和法国被允许用于个性化治疗，但由于生产过程的生物安全性和效率问题，其广泛应用仍面临挑战。

无细胞合成系统的创新

本研究的核心创新在于开发了一个全面的无细胞平台，用于个性化生产、瞬时工程和噬菌体蛋白组学表征。该平台利用无细胞表达系统，能够在微升规模的反应中快速、安全地生产噬菌体，并且能够进行时间分辨的蛋白组学分析，从而揭示噬菌体组装过程中的蛋白表达。通过质谱分析，研究人员验证了假设蛋白和非结构蛋白的存在，并监测了噬菌体组装过程中的蛋白表达。这一平台不仅能够生产针对肠聚集性大肠杆菌（EAEC）、鼠疫耶尔森菌和肺炎克雷伯菌的噬菌体，还通过共表达合适的宿主因子，扩展了对革兰氏阳性菌的噬菌体生产。

图1 用于治疗性噬菌体的逆向和正向工程的无细胞平台^[1]

研究方法与结果

研究人员首先通过比较传统细菌依赖性扩增的T7噬菌体与无细胞系统合成的噬菌体的蛋白组成，验证了无细胞系统的有效性。结果显示，无细胞系统生成的噬菌体蛋白组覆盖率达到72%，其中28%为假设蛋白。这一结果表明，无细胞系统能够检测到几乎所有已知的噬菌体蛋白，并验证了至少一半假设蛋白的存在。此外，研究人员还测试了无细胞系统对未表征的CLB-P3噬菌体的应用，发现该系统能够稳定地生产噬菌体。

在时间分辨分析方面，研究人员利用无细胞系统监测了T7噬菌体蛋白表达和噬菌体效价。结果显示，大多数噬菌体蛋白在40分钟后出现，而完全组装的功能性噬菌体则在60分钟后首次出现。这一结果与T7噬菌体已知的基因表达顺序一致，表明无细胞系统能够以单蛋白精度分析蛋白表达动力学。

图2 无细胞合成示意图^[1]

在个性化噬菌体治疗方面，研究人员成功生产了针对不同菌属的噬菌体，包括针对鼠疫耶尔森菌的PhiA1122噬菌体和针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的MUC-5噬菌体。这些噬菌体在无细胞系统中的效价足以用于治疗（>10⁶ pfu/mL），并且在几分钟内即可实现细菌裂解。

非基因组工程化噬菌体

研究人员还引入了一种非基因组噬菌体工程方法，通过共表达修饰蛋白，为噬菌体添加仅限于一个复制周期的功能。例如，他们通过共表达带有聚组氨酸标签（His-tag）和分裂荧光素酶HiBit部分的T7噬菌体小衣壳蛋白Gp10B，成功实现了噬菌体的亲和纯化和检测。这种修饰仅在噬菌体的一个复制周期中存在，显示出高度的生物安全性。

可借鉴的点：

1、无细胞系统的应用：无细胞合成系统为快速生产噬菌体提供了一种高效、安全的替代方案，值得在其他生物医学领域推广。

2、时间分辨蛋白组学分析：通过无细胞系统进行的时间分辨分析为研究噬菌体组装过程中的蛋白表达提供了新的视角，这种方法可以应用于其他病毒或细胞系统的动态研究。

3、非基因组工程化：非基因组工程化方法为噬菌体的功能改造提供了一种安全、灵活的策略，避免了基因编辑带来的生物安全风险。

4、个性化治疗的潜力：该研究为个性化噬菌体疗法的开发提供了新的思路，尤其是在快速响应多重耐药性细菌感染方面具有重要意义。

参考文献：[1] Emslander, Quirin, et al. "Cell-free production of personalized therapeutic phages targeting multidrug-resistant bacteria." Cell chemical biology 29.9 (2022): 1434-1445.