废水中诺如病毒及新冠病毒前处理方法对测序的影响

新冠疫情期间，废水监测作为一种流行病学工具，通过分析废水样本，可以推测出社区内病毒的传播情况。然而，废水样本中存在各种复杂基质得干扰，病毒核酸的浓度较低，使得病毒检测前的富集技术成为监测的核心环节。目前有研究系统评估了四种病毒浓缩方法对新冠病毒和诺如病毒检测的影响，揭示了前处理技术选择对监测结果的关键作用。

研究方法

该研究在2021年10月至11月期间，在英国采集了240份未处理的废水样本，采用四种主流的病毒前处理富集方法进行平行处理：

1.硫酸铵沉淀法（AS）：通过盐析作用沉淀病毒颗粒；

2.聚乙二醇沉淀法（PEG）：利用高分子聚合物的空间排斥效应浓缩病毒；

3.两种超滤法：包括Vivaspin®离心浓缩器（VS）和InnovaPrep®浓缩吸头（IP），通过分子筛原理截留病毒颗粒。

所有样本均加入phi6噬菌体作为过程控制。核酸提取采用自动化磁珠法，并通过RT-qPCR对SARS-CoV-2、诺如病毒GI和GII进行定量。

结果

研究发现，在PCR抑制方面，不同病毒浓缩方法对RT-qPCR的抑制率显著不同。与沉淀法相比，超滤法显著降低了PCR抑制，抑制率最低为2.7%。而相比之下，PEG沉淀法富集后PCR抑制率高达50.7%。主要由于沉淀法携带大量有机杂质（如腐殖酸、多糖）导致聚合酶活性受到抑制，而超滤法通过物理截留有效减少了干扰物。

图1 使用不同病毒富集技术处理的样品新冠病毒RT-qPCR抑制率（引自参考文献）

在病毒定量方面，VS的效果最佳，SARS-CoV-2的检测灵敏度比AS高83.2倍，对诺如病毒GI和GII的检测灵敏度也分别提升了19.5倍和13.5倍。同时VS处理样本的Ct值较AS低2.5个循环（SARS-CoV-2：32.9vs.35.4），显著提升低载量病毒的检出率。

图2 使用不同病毒富集技术处理的废水样品定量结果（引自参考文献）

同时，不同的前处理富集方法对长片段扩增子测序也有一定的影响。长片段测序显示，使用超滤法获得的SARS-CoV-2测序覆盖率高达80%，而AS沉淀法和PEG沉淀法的覆盖率分别仅为10.3%和3.5%。这表明，超滤法在整个基因组的完整性和测序精度上具有显著优势。

图3 使用不同病毒浓缩技术处理样品的诺如病毒长扩增子测序结果（引自参考文献）

总结

研究表明，合适的病毒富集方法至关重要，能够显著提高废水监测的准确性和灵敏度。使用超滤法能够更好地捕捉病原体，提早发现潜在的疫情趋势，为决策提供科学依据。随着全球对废水监测的不断优化和改进，该研究为如何提升病毒监测的效果提供了重要参考。

参考文献：

Scott G, Evens NP, Porter J, Walker DI. The Impact of Viral Concentration Method on Quantification and Long Amplicon Nanopore Sequencing of SARS-CoV-2 and Noroviruses in Wastewater. Microorganisms. 2025, 22;13(2):229. doi: 10.3390/microorganisms13020229