公共卫生安全的有效保障，是维护人类健康、推动社会和谐稳定发展的重要基础。近年来，致病菌引发的各类疾病不断涌现，给人们的生命健康带来了威胁。开发灵敏、多重的致病菌检测平台能够有效阻断疾病传播，为公共卫生安全筑牢防线，从而守护人民的生命安全和健康福祉。目前，用于致病菌检测的经典方法包括微生物培养法、免疫测定法以及聚合酶链式反应（PCR）。微生物培养法被认为是致病菌检测的金标准方法，但是该方法所需培养条件高、培养时间长，且需要复杂的操作流程，因此难以用于大批量样品检测，也无法实现多重检测。免疫测定法虽然具有快速、方便的优势，但往往具有较差灵敏度。此外，PCR技术需要提取和扩增目标核酸，步骤繁琐耗时耗力，而且容易受到气溶胶污染，会影响检测结果准确性。目前已经有许多生物传感器被报道用于解决上述问题，但是对复杂样本中的致病菌进行无需核酸提取和扩增的多重检测仍面临着巨大的挑战。因此，构建一种无需核酸提取和扩增即能同时鉴定多种致病菌的检测方法对食品安全和临床诊断领域的发展至关重要。

可编程显微成像平台流程

本研究提出了一种可编程显微成像平台，利用超亮二维编码荧光微球和CbAgo解码系统对致病菌进行免扩增、灵敏和多重检测。首先，提出了四面体DNA增强的杂交链式反应（TDNA-HCR）用于构建多重信号探针，生成标记有不同荧光基团的超亮聚苯乙烯微球（PS-TDNA-HCR）。刚性TDNA结构通过固定发夹探针和优化荧光基团密度提高了反应效率。在检测过程中，基于适配体的识别系统将致病菌信息转化为gDNA信息，用于激活CbAgo裂解引发链DNA（iDNA），从而使PS-TDNA-HCR表面释放出大量荧光基团，从而实现信号解码。最后，利用基于计算机视觉（CV）的算法，根据微球颜色、大小和数量进行分类，可同时检测多达四种致病菌。本研究开发的可编程显微成像平台为多种致病菌的同时检测提供了一种无需进行DNA提取和扩增新思路，在食品安全和临床诊断领域具有巨大应用潜力。

图1. 可编程显微成像平台流程示意图^[1]

金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的多重检测

由于环境或食物基质的复杂性，多种病原菌检测应用非常重要，这往往导致多种病原菌共存。我们利用两种不同大小的PS微球（3 μm和6 μm）和两组具有不同荧光标记的TDNA-HCR序列构建了用于病原菌检测的二维编码探针库。开发了四组适体序列，将病原菌信号转化为gDNA信号。然后，gDNA信号激活Ago 系统的特异性切割活性。活化的Ago蛋白选择性地切割不同颜色和大小的PS 微球表面的iDNA，从而解码二维编码的探针库，并借助显微镜实现视觉信号输出。最后，当与CV技术结合使用时，该策略允许同时识别四种病原菌

结论

本研究开发了一种可编程显微镜成像平台，该平台使用二维PS微球编码系统和CbAgo解码策略对病原菌进行高灵敏度和多重检测。通过掺入TDNA-HCR修饰的二维编码PS微球，我们显著提高了荧光探针的亮度和耐用性。此外，在编码的PS微球和多色TDNA-HCR之间引入了一种高度特异性的反应机制，实现了1：n信号预扩增，无需DNA扩增。该平台利用CV技术来识别不同大小和颜色的PS微球，提高了病原菌检测的效率和准确性，使其适用于各种病原菌。

参考文献：[1] Wang M, Li L, Wei L, et al. Multiplexed Pathogenic Bacteria Detection via a Two-Dimensional Encoded Fluorescent Microsphere System[J]. Nano Letters, 2025.