通过无靶标扩增侧切增强型CRISPR-CasΦ工具超灵敏检测临床病原体

近年来，血流感染（BSI）每年造成数千万例病例，传统qPCR和培养检测灵敏度不足且耗时长（≥3天）。理想的POCT应具备aM级或无扩增的单细胞分析、1小时内出结果以及低成本一锅法操作。CRISPR诊断（CRISPR-Dx）如DETECTR、SHERLOCK为便携高效诊断提供了新思路，但其仍依赖等温扩增方法。为实现免扩增超灵敏检测，主要聚焦于（1）优化Cas蛋白及gRNA设计；（2）富集或浓缩靶标；（3）构建酶级联反应。一锅法Cas级联系统已将检测限降至单拷贝水平，并实现免扩增操作，然在BSI等临床场景中，要同时兼顾高特异、高灵敏、快速、简便及低成本，仍需进一步创新与优化。

研究原理

设计了无靶标扩增侧支切割增强CRISPR-CasΦ方法（TCC），通过设计和优化用作放大器的DNA（具有双茎环阻断结构域）来增强CasΦ蛋白对报告探针的非特异性侧支切割（图1）。CasΦ（也称为Cas12j）是一种V型蛋白，分子量约为80 kDa。它具有类似于Cas12亚家族的RuvC样结构域和反式切割活性，但与其他V型蛋白的氨基酸序列同一性低于7%。在裂解靶病原体释放其DNA后，靶DNA结合gRNA1和CasΦ复合物（RNP1）以激活CasΦ的侧支切割活性，导致放大器中的双茎环裂解。所得切割产物结合gRNA2，激活RNP2中CasΦ的侧支切割活性。激活的CasΦ再次裂解报告基团产生荧光信号。茎-环-切割/CasΦ-激活/荧光-恢复的循环会放大荧光检测信号，即使目标病原体在临床样本（如血清）中的水平超低，TCC可达到0.18 aM的历史低检测限，并且仅用40分钟，灵敏度优于qPCR，可检测从BSI患者收集的临床样本中低至1.2 CFU/mL的病原体载量。

TCC对亚aM水平靶标的超灵敏检测

在最佳条件下测试TCC对金黄色葡萄球菌Nuc基因片段的灵敏度和特异性，TCC可以检测低至0.18 aM的dsDNA片段。与CasΦ相比，TCC的灵敏度至少提高了6个数量级，表现出超高的灵敏度，优于以前采用的基于CRISPR的无扩增策略。随后在PAM位点和近端引入单核苷酸多态性（SNP）来评估TCC的单碱基鉴别能力。将SNP突变体（M1-M13）与野生型（WT）在2 h的终点荧光值进行比较，WT激活剂的激活效率明显高于其他SNP激活剂，表明TCC平台具有较好的SNP区分能力。

TCC直接检测病原基因组

以培养的金黄色葡萄球菌为模拟样品，进行高温热裂解，获得用于TCC诊断的细胞裂解物，整个工作流程只需至少40 min即可完成病原体诊断。首先，使用不同的裂解液（DEPC H₂O、PBS、Tris-HCl）对金黄色葡萄球菌进行热裂解，结果表明，DEPC H₂O热裂解具有最高的信噪比，并且在不同浓度的裂解产物活化下产生最高的信号，与PBS和Tris-HCl等缓冲液相比，蛋白质在DEPC H₂O中的溶解度最低，从而减少了污染蛋白质对TCC的干扰。TCC可以检测到金黄色葡萄球菌低至1.2 CFU/mL

为了测试TCC检测不同病原体的广泛适用性，设计了靶向大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌特异性gRNA。特异性热图仅在存在来自具有匹配gRNA的相应病原体的裂解物的情况下显示荧光信号。因此，在TCC系统中通过简单的gRNA1设计和替换即可轻松实现病原体的特异性检测。我们始终实现了这三种病原体的超高灵敏度检测（1.2 CFU/mL），这充分证明了TCC对各种病原体的超高灵敏度检测的广泛适用性。

结论

本文提出的TCC方法采用了独特的放大器策略。通过设计一个独特的放大器，其中包含两个用于侧支切割增强CRISPR-CasΦ工具的茎环，通过Cas/RNP复合物与茎环开放放大器之间的结合使持续激活CasΦ蛋白的侧支切割能力成为可能。显著增加的活化CasΦ蛋白进一步间接裂解报告探针产生荧光信号。与金标准qPCR和血培养方法相比，TCC具有卓越的灵敏度（1.2 CFU/mL）和更快的检测时间（低至40分钟），使其在诊断BSI样品中的低病原体浓度方面更加有效。同时TCC的可扩展性允许集成到便携式平台中，使其成为灵活且适用广泛的POC诊断工具。

参考文献：

Chen H, Song F, Wang B, et al. Ultrasensitive detection of clinical pathogens through a target-amplification-free collateral-cleavage-enhancing CRISPR-CasΦ tool [J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 3929.