Nat. Chem.丨合成生物学与有机化学的碰撞：大肠杆菌中从 PET 塑料到药物合成

大肠杆菌中的生物相容性 Lossen 重排 

在合成有机化学的广阔领域中，存在着许多自然界未曾利用的化学反应。将这些非生物反应整合到生物体系中，为我们从可持续原料合成工业化学品提供了一种极具吸引力的方法。近期，《Nature Chemistry》杂志上发表了一篇题为“A biocompatible Lossen rearrangement in Escherichia coli”的研究论文，报道了一种在大肠杆菌中进行的生物相容性 Lossen 重排反应，这一创新成果不仅拓宽了我们对生物体内化学反应的认知边界，更为塑料废弃物的生物修复和升级循环利用开辟了全新途径。

全文概要：

思维脑图：

一、研究背景

自然界中的化学反应虽然精妙绝伦，但种类相对有限。而合成有机化学则能够实现多种自然界中不存在的化学反应。将这些非生物反应引入生物体系，可以使我们利用可再生资源来可持续地合成众多工业化学品，减少对日益减少的化石燃料的依赖。

Lossen 重排反应是一种发现于 1872 年的化学反应，通常由热或金属催化，涉及从双酰化羟胺底物中排除羧酸根。该反应在合成上具有独特优势，可从易得的羧酸生成底物，无需使用叠氮化物试剂，且在温和条件下进行，能生成含伯胺的产物。

二、研究方法与实验设计

2.1 生物相容性 Lossen 重排反应的探索

研究团队最初从 Li 等人的工作以及人工酶中血红素催化的 N - O 插入化学反应获得灵感，推测在水相条件下，一种生物相容性金属催化剂可能能够从 O - 叔戊酰（O - Piv）取代的苯羟胺底物中有效生成中间体氮烯氧化物。为了同时测试催化剂的反应性和生物相容性，他们设计了利用 auxotroph rescue（补充营养救援）实验，选用 para - 羧基 O - 叔戊氧基羟胺 Lossen 重排底物 1 来原位生成细菌生长必需的代谢物对氨基苯甲酸（PABA）。

2.2 催化剂筛选

选取了一系列在文献中报道能促进 Lossen 或 Curtius 重排以及类似反应的金属配合物，包括 FeCl₂、血红素、铁酞菁、亚铁氰化铁、ZnTPP、Zn（PPIX）和 Zn（acac）₂等，将其与 Lossen 底物 1 共同加入到含大肠杆菌 BW25113∆pabB（该菌株缺乏 PABA 生物合成中 aminodeoxychorismate 合酶的催化亚基）的 M9 - 甘油培养基中，通过测量光学密度（OD600）来观察细菌生长情况，进而判断催化剂的效果和反应的生物相容性。 

图1：体外和体内从羧酸合成苯胺

三、关键实验结果与发现

3.1 意外的生物相容性

实验结果出乎意料，即使在没有添加催化剂的情况下，加入底物 1 的培养管中大肠杆菌 BW25113∆pabB 也能生长，这表明 Lossen 重排反应在水相条件下是生物相容的，并且可能在生长培养基中自发进行、由细胞组分（如膜）促进，或者由大肠杆菌中的天然酶催化。进一步通过在不含细胞的 M9 - 甘油培养基中进行对照反应，并利用 N - (1 - 萘基) 乙二胺比色法测定 PABA，发现底物 1 在没有细胞的情况下也能生成 PABA，且通过逐步排除 M9 培养基的各组分，确定了磷酸盐是催化 Lossen 重排反应的关键成分。

  图2：通过营养缺陷型菌株拯救发现反应

3.2 底物与催化剂的优化

对一系列 O - 酰化底物进行筛选，发现含有疏水性和亲水性基团的底物均能转化为芳香胺，其中五氟苯基底物 S2 的反应速率最快，而亲水性的 O - 琥珀酰底物 S6 则失去了 Lossen 反应活性。同时，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析发现，在大肠杆菌 BW25113∆pabB 细胞存在的情况下，底物 1 的消耗增加，表明细胞可能加速了 Lossen 重排反应。

四、塑料废弃物的生物修复应用

4.1 从 PET 制备 Lossen 重排底物

考虑到 Lossen 重排底物 1 可以从聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料废弃物的单体对苯二甲酸合成，研究团队优化了从废弃塑料瓶合成 1 的方法。通过将 PET 碎片水解为对苯二甲酸，随后与 O - 叔戊羟胺三氟甲磺酸盐和丙基磷酰酸酐（T3P）进行酰胺偶联，生成 PET - 1。

4.2 生物修复实验

使用 PET - 1 进行补充营养救援实验，发现大肠杆菌 BW25113∆pabB 能够在 PET - 1 的存在下生长，伴随着底物浓度的定量减少，且在 48 小时后未检测到 PABA。这表明通过将 PABA 缺陷引入微生物菌株，可使细胞生长依赖于 PET 衍生的小分子，从而为 PET 这一大量废弃物和环境污染物的修复提供了一种创新策略。

图3：从 PET 塑料废弃物中合成底物用于生物修复

五、与代谢途径的整合

5.1 控制微生物发酵的化学输出

研究团队首先考察了通过 Lossen 重排救援的细胞是否可用于生物催化反应。以富马酸二甲酯（DMM）和 α - 酮丙烯酸酯（E - 7 和 Z - 7）为底物，在含有底物 1 的大肠杆菌 BW25113∆pabB 培养物中进行实验。结果显示，所有底物均被定量还原为二甲基琥珀酸 6 或 γ - 酮酯 8，且仅在存在 PABA 或 1 时观察到产物形成，表明生物相容性 Lossen 重排可用于控制微生物发酵的化学输出。

5.2 对乙酰氨基酚的生物合成

为进一步评估 Lossen 重排产物是否能被引导进入新的代谢途径，研究团队尝试在工程大肠杆菌中从底物 1 合成对乙酰氨基酚（扑热息痛）10。对乙酰氨基酚目前主要通过化石燃料衍生的苯酚经硝化、还原和 N - 乙酰化反应制备。而在本研究中，通过在大肠杆菌中引入来自蘑菇 Agaricus bisporus 的 aminobenzoate hydroxylase（ABH60）和来自铜绿假单胞菌的乙酰辅酶A依赖的 arylamine N - acyltransferase（PANAT）K211G 突变体，成功实现了从 PABA 经 4 - 氨基苯酚（4 - AP，9）合成对乙酰氨基酚的途径。尽管最初仅得到 4 - 醋氨基苯甲酸（4 - AB）这一副产物，但通过优化基因表达载体和反应条件，最终实现了从底物 1 和 PET - 1 制备对乙酰氨基酚，产率分别达到 86% 和 83%，在进一步优化蛋白表达过程中阿拉伯糖浓度后，使 panat 和 abh60 表达菌株比例降至 1:100，使 PET - 1 产率提高至 92%。

图4：将 Lossen 重排与天然和工程化代谢途径相结合

六、研究结论与意义

本研究首次报道了在大肠杆菌中进行的生物相容性 Lossen 重排反应，该反应由磷酸盐催化，在中性 pH 下进行，对细菌无毒，并且能够在活细胞内形成伯胺产物，其机制与已知的生物合成逻辑不同，为代谢工程中生成含胺代谢物提供了一种新工具。

通过补充营养救援实验，展示了 Lossen 重排反应能够原位生成 PABA，进而控制微生物在发酵和全细胞反应中的生长和化学反应。并且成功从废弃 PET 瓶合成 Lossen 重排底物，并将其代谢转化为生物质和控制全细胞生物转化。

最为关键的是，该研究将 Lossen 重排底物引导进入新的生物合成途径，实现了从塑料废弃物到对乙酰氨基酚的生产，这种利用生物相容性化学反应整合塑料废弃物和药物生产的策略，是单一化学合成或生物合成方法所无法实现的，为可持续化学合成和生物修复领域带来了革命性突破。