导读：在食品安全领域，人诺如病毒（HuNoV）因其极强的传播力和低感染剂量而成为重点监测对象。然而，目前广泛应用的RT-qPCR检测方法虽灵敏却无法判断病毒是否具有感染力，造成风险评估偏高。为解决这一问题，研究人员尝试引入“活性RT-qPCR”技术，即通过添加染料来区分病毒是否仍具感染性。本研究系统评估了三种染料在不同病毒灭活条件下的表现，并与目前唯一可用于HuNoV复制检测的人肠道类器官（HIE）模型进行对比，探讨活性RT-qPCR作为感染力评估工具的可行性及其局限性。

图1. 遵循的工作流程使用三种活力标记，比较通过细胞培养、RT-qPCR和活力 RT-qPCR 评估的病毒传染性[1]。

活性RT-qPCR：原理与技术路径

RT-qPCR检测诺如病毒时无法判断其是否失活，因此近年来学界提出了“活性RT-qPCR”策略，即通过引入能够穿透病毒壳体的染料，如PMAxx™、PtCl₄和CL（Cyanine-based dyes），与暴露的RNA结合并抑制其扩增信号，从而间接排除非感染性病毒的干扰。本研究分别使用这三种染料处理四种病毒株（GI.3、GII.4、GII.6 和 Tulane virus），并比较其在经过热处理、高压处理后的表现。结果发现，在极端灭活条件下（如95℃高温或500 MPa高压），染料处理可显著降低RT-qPCR信号，表明该技术对强烈失活处理较为敏感。然而在中间灭活强度下（如60℃或300–400 MPa处理），活性RT-qPCR仍然不能准确区分感染性与非感染性病毒，表现出“过度估计风险”的倾向。这提示该方法的适用性在真实食品加工环境中仍需谨慎评估。

类器官模型：当前最可靠的感染力标准

研究以人肠道类器官（HIE）模型作为病毒感染力的“金标准”。该模型可模拟人肠道上皮环境，允许诺如病毒在体外复制，是当前唯一能直接检测HuNoV复制活性的系统。研究发现，只有在染料处理后RT-qPCR信号几乎完全消失（如95℃灭活组）时，HIE中也检测不到病毒复制；而在中等灭活组中，即使染料处理后qPCR信号仍存在，HIE中却无法检测到感染性病毒。这一对比明确表明，活性RT-qPCR方法只能在灭活程度非常充分的条件下才与真实感染力相吻合。在处理强度较低、但仍可能影响病毒活性的实际条件下，如部分巴氏杀菌或中压处理，活性染料无法提供准确判断。研究进一步发现，染料CL的性能较为均衡，PMAxx™抑制力最弱，而PtCl₄虽强但可能干扰HIE中的病毒活性，反而降低检测一致性。

技术局限与实际应用展望

研究还模拟了食品场景，在草莓泥中对病毒进行高压处理，并比较了活性RT-qPCR与HIE的检测结果。发现食品基质对病毒具有一定保护作用，降低了灭活效果，同时也增加了染料穿透病毒颗粒的难度。说明在复杂样品中，活性RT-qPCR面临信号干扰、假阴性或假阳性风险。综合分析，作者认为活性RT-qPCR作为传统RT-qPCR的增强工具，在某些特定灭活处理下具有潜力，但尚不能取代HIE模型进行病毒感染力判断。其应用价值在于作为前处理或筛选手段，为高风险食品或样本提供初步感染力判别；而在风险评估或消毒工艺验证等关键场景，仍需借助更可靠的病毒培养系统或多方法联合验证。未来研究方向建议包括优化染料选择和处理流程，提高染料对中等灭活病毒的判别能力，或结合纳米探针、微流控芯片等新型技术，实现对病毒感染力的快速准确评估。

参考文献：

[1] Wales S Q, Pandiscia A, Kulka M, et al. Challenges for estimating human norovirus infectivity by viability RT-qPCR as compared to replication in human intestinal enteroids[J]. International journal of food microbiology, 2024, 411: 110507.